ZESTAW ELISA do dwuniciowego RNA (dsRNA).

Zestaw ten jest testem immunoenzymatycznym sprzężonym (ELISA) z układem biotyna-streptawidyna, służącym do ilościowego pomiaru dsRNA o długości powyżej 60 par zasad (bp), niezależnie od sekwencji.Płytkę wstępnie pokryto przeciwciałem anty-dsRNA.Dodaje się dsRNA obecny w próbce i wiąże się z przeciwciałami opłaszczonymi na dołkach.Następnie dodaje się biotynylowane przeciwciało anty-dsRNA i wiąże się z dsRNA w próbce.Po przemyciu dodaje się HRP-Streptawidynę, która wiąże się z biotynylowanym przeciwciałem anty-dsRNA.Po inkubacji niezwiązana HRP-Streptawidyna zostaje wypłukana.Następnie dodaje się roztwór substratu TMB i katalizuje za pomocą HRP w celu wytworzenia produktu w kolorze niebieskim, który po dodaniu kwaśnego roztworu zatrzymującego zmienia kolor na żółty.Gęstość koloru żółtego jest proporcjonalna do docelowej ilości dsRNA wychwyconego na płytce.Absorbancję mierzy się przy 450 nm.

Aplikacja

Zestaw ten służy do ilościowego pomiaru resztkowego dsRNA.

Elementy zestawu

Przechowywanie i stabilność

1. W przypadku nieużywanego zestawu: cały zestaw można przechowywać w temperaturze 2 ~ 8 ℃ w okresie przydatności do spożycia.Ze względu na stabilność przechowywania należy unikać silnego światła.

2. W przypadku używanego zestawu: Po otwarciu mikropłytki należy zamknąć nieużywane dołki zaklejką do płytek i włożyć je z powrotem do torebki foliowej zawierającej środek pochłaniający wilgoć, zamknąć torebkę foliową zamkiem błyskawicznym i jak najszybciej po użyciu umieścić z powrotem w temperaturze 2~8°C.Pozostałe odczynniki należy jak najszybciej po użyciu przywrócić do temperatury 2~8°C.

Materiały wymagane, ale niedostarczone

1. Czytnik mikropłytek z filtrem 450±10 nm (lepiej, jeśli wykrywa przy długości fali 450 i 650 nm).

2. Wytrząsarka do mikropłytek.

3. Końcówki i probówki wirówkowe wolne od RNaz.

Schemat działania

Zanim zaczniesz

1. Przed użyciem wszystkie elementy zestawu i próbki doprowadzić do temperatury pokojowej (18–25°C).Jeżeli zestaw nie zostanie zużyty jednorazowo, należy wyjąć wyłącznie paski i odczynniki do bieżącego eksperymentu, a pozostałe paski i odczynniki pozostawić w wymaganym stanie.

2. Bufor do przemywania: rozcieńczyć 40 ml 20 x stężonego buforu do przemywania 760 ml wody dejonizowanej lub destylowanej w celu przygotowania 800 ml 1 x buforu do przemywania.

3. Standard: krótko odwiruj lub odwiruj roztwór podstawowy przed użyciem.Stężenie czterech dostarczonych standardów wynosi 5 ng/μL.W przypadku standardów dsRNA UTP i pUTP należy rozcieńczyć roztwór podstawowy buforem STE do 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0 pg/μL w celu narysowania krzywej standardowej.W przypadku standardów dsRNA N1-Me-pUTP należy rozcieńczyć roztwór podstawowy buforem STE do 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0 pg/μL w celu narysowania krzywej standardowej.W przypadku standardu dsRNA 5-OMe-UTP należy rozcieńczyć roztwór podstawowy buforem STE do 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625,0 pg/µl, aby narysować krzywą standardową.Zalecamy, aby standardy można rozcieńczyć w następujący sposób:

4. Biotynylowane przeciwciało wykrywające i roztwór roboczy HRP-streptawidyny: przed użyciem krótko odwirować lub odwirować roztwór podstawowy.Rozcieńczyć je do stężenia roboczego buforem rozcieńczającym.

5. Substancja TMB: zaaspirować potrzebną dawkę roztworu wysterylizowanymi końcówkami i nie wlewać ponownie pozostałości roztworu do fiolki.Podstan TMB jest wrażliwy na światło, nie należy wystawiać podłoża TMB na działanie światła przez długi czas.

Korzystanie z protokołu

1. Określ liczbę pasków wymaganą do wykonania testu.Aby je wykorzystać, włóż paski do ramek.Pozostałe paski płytek nieużywane w tym teście należy ponownie zapakować do torebki ze środkiem osuszającym.Aby przechowywać w lodówce, szczelnie zamknij torebkę.

2. Dodaj po 100 μl każdego rozcieńczenia standardu, ślepej próby i próbek do odpowiednich dołków.Przykryć uszczelniaczem do płytek.Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, wytrząsając przy 500 obr./min.Aby oznaczenie było dokładne, próbki należy rozcieńczyć buforem STE do odpowiedniego stężenia.

3. Etap płukania: Zaaspirować roztwór i przemyć 250 µl buforu do płukania do każdej studzienki i pozostawić na 30 s.Całkowicie wyrzucić bufor płuczący, zatrzaskując płytkę na papierze chłonnym.Całość umyj 4 razy.

4. Do każdej studzienki dodać 100 µl roztworu roboczego biotynylowanego przeciwciała wykrywającego.Przykryć uszczelniaczem do płytek.Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, wytrząsając przy 500 obr./min.

5. Powtórzyć etap prania.

6. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu roboczego HRP-streptawidyny.Przykryć uszczelniaczem do płytek.Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, wytrząsając przy 500 obr./min.

7. Powtórzyć ponownie etap prania.

8. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu substratu TMB.Przykryć uszczelniaczem do płytek.Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem.Po dodaniu roztworu substratu ciecz zmieni kolor na niebieski.

9. Dodaj 50 µl roztworu zatrzymującego do każdego dołka.Po dodaniu roztworu zatrzymującego ciecz zmieni kolor na żółty.Następnie uruchom czytnik mikropłytek i natychmiast przeprowadź pomiar przy 450 nm.

Obliczanie wyników

1. Uśrednij podwójne odczyty dla każdego standardu, kontroli i próbek i odejmij średnią zerową gęstość optyczną wzorca.Skonstruuj krzywą standardową z absorbancją na osi pionowej (Y) i stężeniem dsRNA na osi poziomej (X).

2. Zaleca się wykonanie obliczeń za pomocą komputerowego oprogramowania do dopasowywania krzywych, takiego jak curve expert 1.3 lub ELISA Calc w 5 lub 4-parametrowym nieliniowym modelu dopasowania.

Wydajność

1. Czułość:

dolna granica wykrywalności: ≤ 0,001 pg/μL (dla UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (dla 5-OMe-UTP-dsRNA).

dolna granica oznaczalności: 0,0156 pg/μL (dla UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (dla N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (dla 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precyzja: CV w ramach testu ≤10%, CV między testami ≤10%

3. Regeneracja: 80% ~ 120%

4. Liniowość: 0,0156-0,5 pg/μL (dla UTP-, pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/μL (dla dsRNA N1-Me-pUTP), 0,0625-1 pg/μL (dla 5-OMe-UTP-dsRNA).

Rozważania

1. Temperatura i czas reakcji TMB są krytyczne, należy je ściśle kontrolować zgodnie z instrukcją.

2. Aby uzyskać dobrą powtarzalność i czułość testu, niezbędne jest odpowiednie przemycie płytek w celu usunięcia nadmiaru nieprzereagowanych odczynników.

3. Wszystkie odczynniki należy dokładnie wymieszać przed użyciem i unikać pęcherzyków podczas dodawania próbki lub odczynników.

4. Jeśli w stężonym buforze do przemywania (20x) utworzyły się kryształy, podgrzej go do 37℃ i delikatnie mieszaj, aż kryształy całkowicie się rozpuszczą.

5. Unikaj oznaczania próbek zawierających azydek sodu (NaN3), ponieważ może to zniszczyć aktywność HRP, co może skutkować niedoszacowaniem ilości dsRNA.

6. Unikaj zanieczyszczenia RNazą podczas testu.

7. Standard/próbkę, przeciwciało wykrywające i SA-HRP można także przeprowadzić w temperaturze pokojowej bez wytrząsania, ale może to spowodować jednokrotne zmniejszenie czułości wykrywania.W tym przypadku zalecamy rozcieńczenie standardów dsRNA UTP i pUTP od 2 pg/μL, standardów dsRNA N1-Me-pUTP od 4 pg/μL, a standardu dsRNA 5-OMe-UTP od 8 pg/μL.Dodatkowo inkubować roztwór roboczy HRP-streptawidyny przez 60 minut w temperaturze pokojowej.Nie używaj wytrząsarki do kolb, ponieważ wytrząsarka może spowodować niedokładny wynik.

Typowy wynik

1. Dane krzywej standardowej

2. Obliczanie krzywej standardowej

3. Zakres wykrywania wykładziny: 0,0312-1 pg/μL