mRNA Cap2'-O-metylotransferaza

mRNA Cap 2'-O-metylotransferaza została uzyskana z rekombinowanego szczepu E. coli niosącego gen mRNA Cap 2'-O-metylotransferazy krowianki.Enzym ten dodaje grupę metylową w pozycji 2'-O pierwszego nukleotydu sąsiadującego ze strukturą czapeczki na końcu 5' RNA. Enzym wykorzystuje S-adenozylometioninę (SAM) jako donor metylu do metylacji RNA zakończonego czapeczką (cap -0), co daje strukturę cap-1.

Struktura Cap1 może zwiększyć wydajność translacji, poprawiając ekspresję mRNA w eksperymentach transfekcji i mikroiniekcji. Enzym ten specyficznie wymaga RNA z czapeczką m7GpppN jako substratem.Nie może wykorzystywać RNA z pN, ppN, pppN lub GpppN na końcu 5'.RNA z czapeczką można przygotować poprzez transkrypcję in vitro przy użyciu analogu czapeczki lub poprzez enzymatyczne capping przy użyciu enzymu Vaccinia Capping Enzyme.

składniki

mRNA Cap 2'-O-metylotransferaza (50U/μL)

10×Bufor reakcyjny zamykający

Składowanie

-25 ～- 15 ℃ podczas przechowywania (Unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania)

Bufor do przechowywania

20 mM Tris-HCl (pH 8,0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% gliceryny.

Definicja jednostki

Jedną jednostkę definiuje się jako ilość enzymu wymaganą do metylacji 10 pmoli transkryptu RNA z czapeczką o długości 80 nukleotydów w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C.

Testy kontroli jakości

Egzonukleaza:50 U mRNA Cap 2'-O-metylotransferazy z 1 μg DNA trawionego λ-Hind III w temperaturze 37°C przez 16 godzin nie powoduje degradacji, jak określono metodą elektroforezy w żelu agarozowym.

Endonukleaza: 50 U mRNA Cap 2'-O-metylotransferazy z 1 μg λDNA w temperaturze 37°C przez 16 godzin nie powoduje degradacji, jak określono metodą elektroforezy w żelu agarozowym.

Nickase: 50 U mRNA Cap 2'-O-metylotransferazy z 1 μg pBR322 w temperaturze 37°C przez 16 godzin nie powoduje degradacji, co określono metodą elektroforezy w żelu agarozowym.

RNaza: 50 U mRNA Cap 2 ℃ -O-metylotransferazy z 1,6 µg RNA MS2 przez 4 godziny w 37°C nie powoduje degradacji, co określono metodą elektroforezy w żelu agarozowym.

E. coli DNA: 50U mRNA Cap 2 ′-O-metylotransferazy przeszukuje się pod kątem obecnościE. coli genomowego DNA przy użyciu TaqMan qPCR ze starterami specyficznymi dlaE. coli Locus 16S rRNA.TheE. coli zanieczyszczenie genomowym DNA wynosi =1E. coli genom.

Bakteryjny Endotoksyna: Test LAL, zgodnie z Farmakopeą Chińską, wydanie IV 2020, metoda testu żelowego, zasada ogólna (1143).Zawartość endotoksyn bakteryjnych powinna wynosić =10 EU/mg.

Układ i warunki reakcji

1. Połączyć odpowiednią ilość RNA z czapeczką i H2O wolną od RNazy w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mL do końcowej objętości 16,0 µl.

2. Ogrzewać w temperaturze 65°C przez 5 minut, a następnie umieścić w łaźni lodowej przez 5 minut.

3. Dodaj następujące składniki w określonej kolejności (w celu metylacji RNA z czapeczką

mniej niż 10

*10× Bufor do reakcji zamykania: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25°C), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT.

4. Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę (w przypadku fragmentu docelowego mniejszego niż 200 nt zaleca się 2 godziny inkubacji).

Aplikacje

Aby poprawić ekspresję mRNA podczas eksperymentów z mikroiniekcjami i transfekcją.

Uwagi dotyczące użytkowania

1. Przed reakcją RNA należy oczyścić i rozpuścić w wodzie wolnej od nukleaz, wszystkie roztwory nie powinny zawierać EDTA i jonów.

2. Zaleca się ogrzewanie próbki RNA w temperaturze 65°C przez 5 minut przed reakcją w celu usunięcia struktury drugorzędowej na końcu 5 transkryptu.Można go wydłużyć do 10 minut w przypadku złożonej struktury 5-końcowej.