PNGaza F
Peptyd-N-Glikozydaza F (PNGase F) jest najskuteczniejszą metodą enzymatyczną usuwania prawie wszystkich N-połączonych oligosacharydów z glikoprotein.PNGaza F jest amidazą, która rozszczepia najbardziej wewnętrzne reszty GlcNAc i asparaginy oligosacharydów o wysokiej zawartości mannozy, hybrydowych i złożonych z N-połączonych glikoprotein.
Aplikacja
Enzym ten jest przydatny do usuwania reszt węglowodanów z białek.
Przygotowanie i specyfikacja
| Wygląd | Bezbarwna ciecz |
| Czystość białka | ≥95% (ze strony SDS-PAGE) |
| Działalność | ≥500 000 j./ml |
| Egzoglikozydaza | Nie wykryto żadnej aktywności (ND) |
| Endoglikozydaza F1 | ND |
| Endoglikozydaza F2 | ND |
| Endoglikozydaza F3 | ND |
| Endoglikozydaza H | ND |
| Proteaza | ND |
Nieruchomości
| Numer WE | 3.5.1.52(Rekombinowany z mikroorganizmu) |
| Waga molekularna | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Punkt izoelektryczny | 8. 14 |
| Optymalne pH | 7,0-8,0 |
| Optymalna temperatura | 65°C |
| Specyfika podłoża | Rozszczepianie wiązań glikozydowych pomiędzy GlcNAc i resztami asparaginy Ryc.1 |
| Miejsca rozpoznawania | N-glikany, chyba że zawierają α1-3 fukozę Ryc. 2 |
| Aktywatory | NTC |
| Inhibitor | SDS |
| Temperatura przechowywania | -25 ~ -15 ℃ |
| Inaktywacja cieplna | 20 µl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 µl PNGazy F inaktywuje się przez inkubację w temperaturze 75°C przez 10 minut. |
Ryc. 1 Specyficzność substratowa PNGazy F
Ryc. 2 Miejsca rozpoznawania PNGazy F.
Kiedy wewnętrzne reszty GlcNAc są połączone z α1-3 fukozą, PNGaza F nie może oddzielić N-połączonych oligosacharydów od glikoprotein.Modyfikacja ta jest powszechna w roślinach i niektórych glikoproteinach owadów.
Ckomponenty
|
| składniki | Stężenie |
| 1 | PNGaza F | 50 ul |
| 2 | 10×bufor denaturujący glikoproteinę | 1000 ul |
| 3 | 10×Bufor Gliko 2 | 1000 ul |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 ul |
Definicja jednostki
Jedną jednostkę (U) definiuje się jako ilość enzymu wymaganą do usunięcia > 95% węglowodanów z 10 µg zdenaturowanej RNazy B w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C w całkowitej objętości reakcji wynoszącej 10 µl.
Warunki reakcji
1. Rozpuścić 1-20 µg glikoproteiny w wodzie dejonizowanej, dodać 1 µl 10 x buforu denaturującego glikoproteinę i H2O (jeśli to konieczne), aby uzyskać całkowitą objętość reakcji wynoszącą 10 µl.
2.Inkubować w temperaturze 100°C przez 10 min, ochłodzić na lodzie.
3.Dodać 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 i wymieszać.
4.Dodać 1-2 µl PNGazy F i H2O (jeśli to konieczne), aby uzyskać całkowitą objętość reakcji wynoszącą 20 µl i wymieszać.
5.Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37°C przez 60 minut.
6.Do analizy SDS-PAGE lub analizy HPLC.
