5×Neoscript Fast RT-qPCR Premiks plus-UNG
Nr kat.: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) to wysoce stabilna, jednoprobówkowa mieszanka oparta na sondzie, odpowiednia do jednoetapowej odwrotnej transkrypcji i ilościowej reakcji PCR (qRT-PCR).Wspomaga wstępne mieszanie starterów i sond i pozostaje stabilny po długim czasie przechowywania w niskiej temperaturze.Badaną próbkę można dodać bezpośrednio podczas użycia, bez konieczności dodatkowego otwierania probówki/pipetowania.Ten produkt zawiera składniki, np. polimerazę DNA typu hot-start, M-MLV, termolabilną uracylową glikozylazę DNA (TS-UNG), inhibitor RNazy, MgCl2, dNTP (z dUTP zamiast dTTP) i stabilizatory.Dzięki genetycznie zmodyfikowanej odwrotnej transkryptazie i polimerazie DNA o szybkiej amplifikacji możliwe jest zakończenie amplifikacji PCR w ciągu 20-40 minut.Odczynnik ten wykorzystuje specjalny bufor do qPCR z mieszanymi enzymami enzymu amplifikującego o działaniu hamującym i enzymu UNG.Dlatego może uzyskać dobrą amplifikację genów docelowych i zapobiec fałszywej amplifikacji spowodowanej pozostałościami PCR i zanieczyszczeniem aerozolami.Odczynnik ten jest kompatybilny z większością fluorescencyjnych urządzeń do ilościowego PCR takich producentów jak Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad i Roche.
Część
1.25×Neoscriptowa mieszanka szybkiej RTazy/UNG
2.5×bufor premiksu Neoscript Fast RT (dUTP)
Warunki przechowywania
Wszystkie elementy należy przechowywać w temperaturze -20 ℃ w przypadku długotrwałego przechowywania i 4 ℃ przez okres do 3 miesięcy.Po rozmrożeniu należy dokładnie wymieszać i odwirować przed użyciem.Unikaj częstego zamrażania i rozmrażania.
Przygotowanie układu reakcyjnego qRT-PCR
| składniki | 25µlSystem | 50µlSystem | Końcowe stężenie |
| 5×bufor premiksu Neoscript Fast RT (dUTP) | 5µl | 10µL | 1× |
| 25×Neoscriptowa mieszanka szybkiej RTazy/UNG | 1µl | 2µl | 1× |
| 25×Mieszanka gruntu i sondya | 1µl | 2µl | 1× |
| Szablon RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Do 25μL | Do 50μl | – |
1) a. Końcowe stężenie startera wynosi zwykle 0,2 μM.Aby uzyskać lepsze rezultaty, można zoptymalizować stężenie startera w zakresie 0,2-1 µM.Generalnie stężenie sondy można optymalizować w zakresie 0,1-0,3 µM.
2) b.W przypadku stosowania szybkiej procedury PCR zwiększenie stężenia starterów i sond może skutkować lepszymi wynikami amplifikacji, dlatego należy odpowiednio zoptymalizować ich stosunek.
3) Różne typy próbek zawierają różne rodzaje i zawartość inhibitora oraz liczbę kopii genu docelowego.Objętość próbki należy uwzględnić w oparciu o rzeczywisty stan.W razie potrzeby rozcieńczyć próbkę wodą wolną od nukleaz lub buforem TE.
Reakcja Cwarunki
| Regularna procedura PCR | Szybka procedura PCR | ||||||
| Procedura | Temp. | Czas | Cykl | Procedura | Temp. | Czas | Cykl |
| Transkrypcja odwrotna | 50 ℃ | 10-20 minut | 1 | Transkrypcja odwrotna | 50 ℃ | 5 minut | 1 |
| Polimeraza Aktywacja | 95 ℃ | 1-5 minut | 1 | Polimeraza Aktywacja | 95 ℃ | lata 30 | 1 |
| Denaturacja | 95 ℃ | 10-20 s | 40-50 | Denaturacja | 95 ℃ | 1-3 s | 40-50 |
| Wyżarzanie I Rozszerzenie | 56-64 ℃ | 20-60 lat | Wyżarzanie I Rozszerzenie | 56-64 ℃ | 3-20 s | ||
Kontrola jakości
1.Detekcja funkcji: czułość, swoistość i powtarzalność qPCR.
2.Brak aktywności egzogennej nukleazy: brak zanieczyszczenia egzogenną endonukleazą i egzonukleazą.
Notatki
1.Szybkość amplifikacji szybkiej polimerazy DNA jest nie mniejsza niż 1 kb/10 s.Różne urządzenia do PCR mają różne prędkości ogrzewania i chłodzenia, tryby kontroli temperatury i przewodność cieplną, dlatego też optymalizacja stężenia startera/sondy i metody analizy w połączeniu z konkretnym urządzeniem do szybkiego PCR jest niezbędna.
2.Produkt ten ma szerokie zastosowanie i nadaje się do diagnostyki molekularnej o wysokiej czułości.W przypadku starterów o niskiej temperaturze hybrydyzacji lub amplifikacji długich fragmentów o długości powyżej 200 bp zaleca się trzyetapową metodę PCR.
3.Ponieważ różne amplikony mają różną skuteczność wykorzystania dUTP i różną czułość na UNG, odczynniki należy optymalizować, jeśli czułość wykrywania zmniejsza się w przypadku stosowania systemu UNG.W razie potrzeby skontaktuj się z nami, aby uzyskać pomoc techniczną.
4.Aby uniknąć amplifikacji produktów PCR z przeniesienia, do amplifikacji wymagane jest wydzielone miejsce doświadczalne i pipeta.Używaj rękawiczek i często je zmieniaj. Po amplifikacji nie otwieraj probówki do PCR.
