Zestaw EndoFree Plasmid Maxi
Zestaw ten nadaje się do ekstrakcji ze 150–300 ml roztworu bakteryjnego hodowanego przez noc, przy użyciu ulepszonej metody lizy alkalicznej SDS w celu lizy bakterii.Surowy ekstrakt jest selektywnie łączony z unikalnym zmiataczem endotoksyn i oddzielany przez wirowanie w celu usunięcia endotoksyn.Następnie membrana z żelu krzemionkowego selektywnie wiąże się z plazmidowym DNA w roztworze w warunkach wysokiego zasolenia i niskiego pH.Następnie dodaje się bufor płuczący w celu usunięcia zanieczyszczeń i innych składników bakteryjnych.Na koniec, do elucji czystego plazmidowego DNA z membrany krzemowej matrycy stosuje się bufor elucyjny o niskiej zawartości soli i wysokim pH.Membrana z żelu krzemionkowego wykorzystuje specjalną membranę adsorpcyjną, a różnica wielkości adsorpcji między kolumną a kolumną jest bardzo mała, a powtarzalność jest dobra.Fenol, chloroform i inne toksyczne odczynniki nie są wymagane, podobnie jak etapy wytrącania etanolem.Zestawu tego można użyć do szybkiej ekstrakcji 0,2–1,5 mg czystego plazmidowego DNA o dużej liczbie kopii, z szybkością ekstrakcji 80–90%.W zestawie zastosowano unikalną formułę procesu usuwania endotoksyn, zawartość endotoksyn jest wyjątkowo niska, a efekt transfekcji komórek jest doskonały.Wyekstrahowany plazmid można bezpośrednio wykorzystać w trawieniu enzymatycznym, PCR, transkrypcji in vitro, transformacji, sekwencjonowaniu i innych eksperymentach z zakresu biologii molekularnej.
Warunki przechowywania
RNaseA należy przechowywać w temperaturze -30 ~ -15 ℃ i transportować w temperaturze ≤0 ℃.
Środek usuwający endotoksyny można przechowywać w temperaturze 2 ~ 8 ℃ przez jeden miesiąc, w temperaturze -30 ~ -15 ℃ w celu przechowywania długoterminowegoi transportowany w temperaturze ≤0 ℃.
Pozostałe składniki należy przechowywać w temperaturze pokojowej (15 ~25℃) i transportować w temperaturze pokojowej.
składniki
| składniki | 10RXNS |
| RNaza A | 750 µl |
| Bufor P1 | 75ml |
| Bufor P2 | 75ml |
| Bufor P4 | 75ml |
| Zmiatacz endotoksyn | 25ml |
| Bufor PW | 2 × 22ml |
| Bufor gruźlicy | 20 ml |
| Kolumny FastPure DNA Maxi (każda w probówce zbiorczej o pojemności 50 ml) | 10 |
| Probówka do pobierania niezawierająca endotoksyn | 2 × 5 |
RNazaA:10 mg/ml, stosowane do usuwania RNA.
Bufor P1:bakteryjnego buforu zawiesinowego, przed pierwszym użyciem dodać RNaseA do buforu P1.
Bufor P2:bakteryjny bufor do lizy (zawierający SDS/NaOH).
Bufor P4:bufor neutralizujący.
Zmiatacz endotoksyn:skutecznie usuwają endotoksynę z surowego ekstraktu plazmidu.
Hasło bufora:buforu płuczącego, przed pierwszym użyciem dodać przewidzianą ilość etanolu.
Bufor TB:bufor do elucji.
Kolumny Maxi FastPure DNA:kolumny adsorpcyjne plazmidowego DNA.
Kolekcja Tuby 50 ml:probówki do zbierania filtratu.
Probówka do pobierania niezawierająca endotoksyn:probówki do zbierania plazmidowego DNA.
Przygotowane materiały
Alkohol absolutny, izopropanol, probówki wirówkowe okrągłodenne 50 ml i 50 ml wolne od endotoksynprobówki wirówkowe.
Aplikacje
Produkt ten nadaje się do ekstrakcji plazmidów na dużą skalę ze 150 - 300 ml roztworu bakteryjnegohodowane przez noc.
Proces eksperymentu
1. Pobrać 150 – 200 ml (nie więcej niż 300 ml) roztworu bakterii hodowanego przez noc i odwirować w temp.około 11 000 obr/min (12 000 × g) przez 1 – 2 min.Wyrzucić supernatant i zebrać bakterie.
Δ W przypadku pobrania więcej niż 50 ml roztworu bakterii, bakterie można zebrać poprzez dodanie roztworu bakterii, odwirowanie, odrzucenie supernatantu i inne etapy w tej samej probówce o pojemności 50 ml przez
wiele razy.
2. Dodać 7,5 ml Bufora P1 (proszę sprawdzić, czy do Bufora P1 dodano RNaseA) do wirówkiprobówkę zawierającą bakterie i dokładnie wymieszać poprzez wirowanie lub pipetowanie.
Δ Całkowite zawieszenie bakterii na tym etapie ma kluczowe znaczenie dla uzyskania zawiesiny, a po zawieszeniu nie powinno być żadnych grudek bakteryjnych.Jeśli występują grudki bakteryjne, które nie są dokładnie wymieszane, będzie to miało wpływ na lizę, co spowoduje niską wydajność i czystość.Jeżeli OD600 roztworu bakteryjnego wynosi 0,65, zaleca się użycie 7,5 ml buforu P1 do ekstrakcji ze 150 ml roztworu bakteryjnego;gdy OD600 wynosi 0,75, należy użyć 8 ml buforu P1 i odpowiednio zmienić objętość buforów P2 i P4.W przypadku zwiększenia objętości roztworu bakteryjnego do 200 ml zaleca się, aby:objętość buforów P1, P2 i P4 należy zwiększyć proporcjonalnie.
3. Dodaj 7,5 ml Buffera P2 do zawiesiny bakteryjnej z kroku 2 i delikatnie mieszaj w górę i w dół przez 6 – 8razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 4 – 5 minut.
Δ Delikatnie odwrócić, aby dokładnie wymieszać.Worteksowanie spowoduje fragmentację genomowego DNA, w wyniku czego w wyekstrahowanym plazmidzie powstaną fragmenty genomowego DNA.W tym czasie roztwór staje się lepki i półprzezroczysty, co świadczy o całkowitej lizie bakterii.Czas trwania nie powinien przekraczać 5 minut, aby uniknąć zniszczenia plazmidów.Jeśli roztwór nie jest klarowny, może w nim znajdować się zbyt wiele bakteriiniepełna liza, dlatego należy odpowiednio zmniejszyć ilość bakterii.
4. Dodaj 7,5 ml Buffera P4 do zawiesiny bakteryjnej z etapu 3 i natychmiast delikatnie odwróć 6 – 8 razy, aby roztwór całkowicie zneutralizował Buffer P2.W tym czasie powinien pojawić się biały kłaczkowaty osad.Wiruj z prędkością ponad około 11 000 obr./min (12 000 × g) przez 10–15 minut, ostrożnie odpipetuj supernatant do nowej okrągłodennej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml (przygotowanej samodzielnie) i unikajodessać pływający biały osad.
Δ Dodać bufor P4 i natychmiast odwrócić, aby dobrze wymieszać.Pozostaw probówkę do odstania, aż biały osad rozprowadzi się równomiernie w roztworze, aby zapobiec miejscowemu wytrącaniu się osadu, który mógłby mieć wpływ na neutralizację.Jeśli przed odwirowaniem nie wytrąci się jednolity biały kłaczkowaty osad, a supernatant po odwirowaniu nie będzie przezroczysty, probówkę możnawirowano przez kolejne 5 minut.
5. Dodać 0,1-krotną objętość (10% objętości supernatantu, około 2,2 ml) środka Endotoxin Scavenger do supernatantu z etapu 4 i odwrócić do mieszania.Umieścić roztwór w łaźni lodowej lub włożyć do pokruszonego lodu (lub lodówki z zamrażarką) na 5 minut, aż roztwór zmieni się z mętnego na przezroczysty i przezroczysty (lub nadallekko mętny) i od czasu do czasu kilka razy wymieszać.
Δ Po dodaniu zmiatacza endotoksyn do supernatantu, supernatant stanie się mętny, alesupernatant powinien stać się przezroczysty (lub lekko mętny) po ochłodzeniu w łaźni lodowej.
6. Po umieszczeniu supernatantu w temperaturze pokojowej (>25℃) na 10–15 minut stanie się mętny w miaręjego temperatura wzrasta do temperatury pokojowej.Następnie supernatant należy odwrócić w celu wymieszania.
Δ Jeśli temperatura pokojowa jest niższa lub chcesz skrócić czas ekstrakcji, supernatant można inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 ~ 42 ℃ przez 5 – 10 minut, a następny etap można przeprowadzić po supernatanciestaje się mętny.
7. Odwirować supernatant przy około 11 000 obr./min (12 000 × g) przez 10 minut w temperaturze pokojowej (temperatura musi wynosić > 25°C), aby oddzielić fazy.Górna faza wodna zawiera DNA, podczas gdy dolna niebieska warstwa fazy oleistej zawiera endotoksynę i inne zanieczyszczenia.PrzenieśFazę wodną zawierającą DNA do nowej probówki iodrzucić tłustą warstwę.
Δ Temperatura podczas wirowania musi przekraczać 25 ℃, ponieważ nie zapewnia to skutecznego rozdzielenia fazwystąpić, jeśli temperatura jest zbyt niska.
Δ Jeśli separacja faz nie jest skuteczna, temperaturę wirowania można ustawić na 30 ℃ iczas wirowania można zwiększyć do 15 min.
Δ Nie zasysaj niebieskiej oleistej warstwy, ponieważ zawiera ona endotoksyny i inne zanieczyszczenia.
Mechanizm
Ponowne zawieszenie, liza, neutralizacja
◇ Dodaj 7,5 ml buforu P1
◇ Dodaj 7,5 ml buforu P2
◇ Dodaj 7,5 ml buforu P4
Usuwanie endotoksyn
◇Dodaj 0,1-krotność objętości supernatantu Endotoksyny Scavenger
Wiązanie i pranie
◇ Dodać 0,5-krotną objętość izopropanolu
◇ Dodaj 10 ml buforu PW
◇ Dodaj 10 ml buforu PW
Elucja
◇ Dodać 1 – 2 ml buforu TB lub ddH2O wolnego od endotoksyn
