Odwrotna transkryptaza M-MLV
RevScript Odwrotna transkryptaza otrzymywana jest metodą inżynierii genetycznej.Ma wyższą zdolność syntezy cDNA, stabilność termiczną i granicę temperatury reakcji (do 60°C).Zsyntetyzowany produkt cDNA ma wielkość do 10 kb.Zwiększa powinowactwo matryc i nadaje się do odwrotnej transkrypcji matryc RNA o złożonej strukturze drugorzędowej lub genach o niskiej liczbie kopii.
składniki
| Część | HC2003B (10 000 jednostek) | HC2003B (5*10 000U) | HC2003B (200 000U) |
| Odwrotna transkryptaza RevScript (200U/μL) | 50 µl | 5×50 µl | 1 ml |
| 5 × bufor RevScript | 250 µL | 1,25 ml | 5 ml |
Stan przechowywania
Produkt należy przechowywać w temperaturze -25°C ~ -15°C przez 2 lata.
Definicja jednostki
Jedna jednostka włącza 1 nmol dTTP do materiału nierozpuszczalnego w kwasie w ciągu 10 minut w temperaturze 37°C, stosując Oligo(dT) jako startery.
Konfiguracja reakcji
1.Denaturacja matrycy RNA (ten etap jest opcjonalny, denaturacja matrycy RNA pomaga otworzyć struktury drugorzędowe, co poprawi wydajność pierwszej nici cDNA).
| składniki | Tom (µl) |
| ddH wolny od RNazy2O | Do 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/l) lub losowy starter (50 μmol/l) Lub startery specyficzne dla genu (2 μmol/l) | 1 |
| lub 1 | |
| lub 1 | |
| Szablon RNA | X a |
Uwagi:
1) a: Całkowity RNA: 1-5 µg lub mRNA: 1-500 ng
2) Inkubacja w temperaturze 65°C przez 5 minut, następnie natychmiastowe przeniesienie na lód w celu schłodzenia na 2 minuty.Krótkie wirowanie w celu zebrania cieczy reakcyjnej, dodać roztwór reakcji odwrotnej transkrypcji, jak pokazano w poniższej tabeli.Delikatnie pipetować w celu wymieszania.
1.Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej (objętość 20 µl)
| składniki | Tom (µl) |
| Mieszanka poprzedniego kroku | 13 |
| 5×Bufor | 4 |
| Mieszanka dNTP (10 nmol/L) | 1 |
| Odwrotna transkryptaza (200 U/μL) | 1 |
| Inhibitor RNazy (40 U/μL) | 1 |
1.Przeprowadź reakcję w następujących warunkach:
| Temperatura (°C) | Czas |
| 25°Ca | 5 minut |
| 42°Cb | 15-30 minut |
| 85°Cc | 5 minut |
Uwagi:
1)Inkubacja w temperaturze 25°C przez 5 minut jest wymagana tylko w przypadku użycia losowych heksamerów.Proszę pominąć ten krok w przypadku korzystania z Oligo (dT)18lub podkład specyficzny dla genu.
2) b.Zalecana temperatura odwrotnej transkrypcji to 42°C. W przypadku matryc o skomplikowanych strukturach drugorzędowych lub dużej zawartości GC zaleca się podniesienie temperatury reakcji do 50-55°C.
3) c.Ogrzewanie w temperaturze 85°C przez 5 minut w celu inaktywacji odwrotnej transkryptazy.
4) Produkt można bezpośrednio zastosować w reakcjach PCR lub qPCR lub przechowywać w temperaturze -20°C w celu krótkotrwałego przechowywania.W celu długotrwałego przechowywania zaleca się wymieszanie produktów i przechowywanie w temperaturze -80°C.Unikaj częstego zamrażania i rozmrażania.
5) Produkt nadaje się do jednoetapowej RT-qPCR, zaleca się dodać 10-20 U odwrotnej transkryptazy na każde 25µL układu reakcyjnego lub stopniowo zwiększać ilość odwrotnej transkryptazy w zależności od aktualnej sytuacji.
Notatki
1.Proszę utrzymywać obszar doświadczalny w czystości;Podczas pracy należy nosić czyste rękawiczki i maskę.Wszystkie materiały użyte w eksperymencie powinny być wolne od RNaz, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą.
2.Wszystkie procedury należy wykonywać na lodzie, aby zapobiec degradacji RNA.
3.Aby zapewnić wysoką skuteczność odwrotnej transkrypcji, zaleca się pobieranie próbek RNA o wysokiej jakości.
4.Ten produkt jest przeznaczony wyłącznie do celów badawczych.
5.Dla własnego bezpieczeństwa prosimy o obsługę w fartuchach laboratoryjnych i rękawiczkach jednorazowych.
