2×Sensi Direct Premix-UNG (sonda qPCR)
Nr kat.: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) jest przeznaczony do przeprowadzania PCR bezpośrednio z próbek, bez ekstrakcji DNA lub przygotowania próbki.Odczynnik ten składa się z polimerazy DNA typu hot-start, glikozylazy DNA uracylu (UNG), inhibitora RNazy, MgCl2, dNTP (z dUTP zamiast dTTP) i stabilizatory do ilościowego PCR (qPCR).Odczynnik ten charakteryzuje się wysoką tolerancją na inhibitory, dlatego można go bezpośrednio stosować do wykrywania próbek takich jak wymaz z gardła, ślina, krew pełna z antykoagulantem, osocze i surowica, bez ekstrakcji DNA.Odczynnik wykorzystuje firmowy bufor do qPCR z mieszanymi enzymami antyinhibicyjnej polimerazy DNA i enzymu UNG.Dlatego może uzyskać dobrą amplifikację docelowych genów w próbkach zawierających inhibitory i hamować fałszywie dodatnią amplifikację spowodowaną pozostałościami PCR i zanieczyszczeniem aerozolem.Odczynnik ten jest kompatybilny z większością fluorescencyjnych urządzeń do ilościowej reakcji PCR, takich jak Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche i tak dalej.
składniki
1. 50×mieszanka enzymów SensiDirect/UNG
2. 2×bufor premiksu SensiDirect (dUTP)
Warunki przechowywania
Wszystkie elementy należy przechowywać w temperaturze -20 ℃ w przypadku długotrwałego przechowywania i 4 ℃ przez okres do 3 miesięcy.Po rozmrożeniu należy dokładnie wymieszać i odwirować przed użyciem.Unikaj częstego zamrażania i rozmrażania.
Protokół rowerowy
| Krok | Temperatura | Czas | Cykl |
| Trawienie | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Aktywacja polimerazy | 95 ℃ | 1-5 minut | 1 |
| Denaturować | 95 ℃ | 10-20 s | 40-50 |
| Wyżarzanie/Wydłużanie | 56-64 ℃ | 20-60 lat |
Instrukcje pipetowania
| Odczynnik | Objętość na reakcja | Objętość na reakcję | Końcowe stężenie |
| 2×bufor premiksu SensiDirect (dUTP) | 12,5 µl | 25µL | 1× |
| 50×mieszanka enzymów SensiDirect/UNG | 0,5 µl | 1µL | 1× |
| 25×Mieszanka gruntu i sondy1, 2 | 1µL | 2µL | 1× |
| Próbka3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Maksymalna głośność | 25 µL | 50 µl | - |
1. Końcowe stężenie podkładu wynosi zwykle 0,2 μM.Aby uzyskać lepsze rezultaty, można zoptymalizować stężenie startera w zakresie 0,2-1 µM.
2. Ogólnie rzecz biorąc, stężenie sondy można optymalizować w zakresie 0,1-0,3 μM.Optymalne stężenie sondy zależy od instrumentu do amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym, typu sondy i rodzaju fluorescencyjnej substancji znakującej.Proszę zapoznać się z instrukcją przyrządu lub szczegółowymi wymaganiami każdej sondy fluorescencyjnej.
3. Różne typy próbek zawierają różne rodzaje i zawartość inhibitora oraz liczbę kopii genu docelowego.Objętość próbki należy uwzględnić w oparciu o rzeczywisty stan.W razie potrzeby rozcieńczyć próbkę, dodając wodę wolną od nukleaz lub bufor TE.
4. Zalecana objętość różnych próbek:
| Próbka | Objętość na jedną 50 µl reakcja | Maksymalny stosunek |
| Krew pełna z antykoagulantem | 2,5 µl | 5% |
| Osocze | 15 µl | 30% |
| Serum | 10 µL | 20% |
| Wymaz z gardła | 10 µL | 20% |
| Ślina | 10 µL | 20% |
Kontrola jakości
1. Wykrywanie funkcji: czułość, swoistość i powtarzalność qPCR.
2. Brak aktywności egzogennej nukleazy: brak zanieczyszczenia egzogenną endonukleazą i egzonukleazą.
Uwagi dotyczące produktu
1. W tym produkcie zastosowano nowy typ polimerazy DNA typu hot-start, którą można aktywować w ciągu 1–5 minut. Ponieważ bufor reakcyjny został zoptymalizowany, jest bardziej odpowiedni do ilościowej reakcji PCR z podwójną lub wielokrotną fluorescencją przy użyciu metody sondy.
2. Jeżeli wartość Rn amplifikacji PCR jest zbyt niska lub amplifikacja jest wyraźnie zahamowana, zmniejszenie ilości próbki, zwiększenie objętości reakcji lub wcześniejsze rozcieńczenie próbki może poprawić wyniki.
3. Pobieranie krwi, śliny, moczu, wymazu z gardła itp. powinno odbywać się zgodnie z wymogami kryteriów klinicznych, a można użyć świeżej próbki, aby zapobiec degradacji kwasu nukleinowego.
4. Ponieważ różne amplikony mają różną skuteczność wykorzystania dUTP i wrażliwość na UNG, odczynniki należy zoptymalizować, jeśli czułość wykrywania zmniejsza się w przypadku stosowania systemu UNG.W razie potrzeby skontaktuj się z nami, aby uzyskać pomoc techniczną.
5. Aby uniknąć amplifikacji produktów PCR przeniesionych pomiędzy reakcjami jednoetapowymi, do amplifikacji wymagane jest wydzielone miejsce doświadczalne i pipeta.Używaj rękawiczek i często je zmieniaj. Nie otwieraj probówki reakcyjnej po amplifikacji PCR.
