Odwrotna transkryptaza M-MLV Neoscript
Odwrotna transkryptaza Neoscript jest odwrotną transkryptazą otrzymywaną poprzez badanie przesiewowe mutacji genu M-MLV wirusa mysiej białaczki Moloneya i ekspresji w E. coli.Enzym usuwa aktywność RNazy H, ma wyższą tolerancję temperaturową i nadaje się do odwrotnej transkrypcji w wysokiej temperaturze.Dlatego jest pomocny w eliminowaniu niekorzystnego wpływu struktury wysokiego poziomu RNA i niespecyficznych czynników na syntezę cDNA, a także ma wyższą stabilność i zdolność syntezy odwrotnej transkrypcji.Enzym ma wyższą stabilność i zdolność syntezy odwrotnej transkrypcji.
składniki
1.200 U/µl odwrotnej transkryptazy Neoscript
2.5 × bufor pierwszej nici (opcjonalnie)
* 5 × Bufor pierwszej nici nie zawiera dNTP, należy dodać dNTP podczas przygotowywania układu reakcyjnego
Zalecana aplikacja
1.Jednoetapowa qRT-PCR.
2.Wykrywanie wirusa RNA.
Stan przechowywania
-20°C w przypadku długotrwałego przechowywania, należy dobrze wymieszać przed użyciem, unikać częstego zamrażania i rozmrażania.
Definicja jednostki
Jedna jednostka zawiera 1 nmol dTTP w ciągu 10 minut w temperaturze 37°C przy użyciu poli(A)·oligo(dT)25jako szablon/podkład.
Kontrola jakości
1.Czystość elektroforetyczna SDS-PAGE większa niż 98%.
2.Czułość amplifikacji, kontrola między partiami, stabilność.
3.Brak aktywności egzogennej nukleazy, brak zanieczyszczenia egzogenną endonukleazą lub egzonukleazą
Konfiguracja reakcji dla pierwszego roztworu reakcji łańcuchowej
1.Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej
| składniki | Tom |
| Oligo(dT)12-18 Elementarz lub Losowy elementarzA Lub startery specyficzne dla genub | 50 pmoli |
| 50 pmoli (20-100 pmoli) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 µl |
| Szablon RNA | Całkowity RNA ≤ 5 μg;mRNA≤ 1 µg |
| dH wolny od RNaz2O | Do 10 µl |
Uwagi:a/b: Proszę wybrać różne rodzaje starterów w zależności od potrzeb eksperymentalnych.
2.Ogrzewać w temperaturze 65°C przez 5 minut i szybko schładzać na lodzie przez 2 minuty.
3.Dodać następujące składniki do powyższego układu do całkowitej objętości 20µL i delikatnie wymieszać:
| składniki | Tom (µl) |
| 5 × bufor pierwszej nici | 4 |
| Odwrotna transkryptaza Neoscript (200 U/μL) | 1 |
| Inhibitor RNazy (40 U/μL) | 1 |
| dH wolny od RNaz2O | Do 20 µl |
4.Proszę przeprowadzić reakcję zgodnie z poniższymi warunkami:
(1) Jeżeli używany jest Random Primer, reakcję należy prowadzić w temperaturze 25°C przez 10 minut, a następnie w temperaturze 50°C przez 30~60 minut;
(2) Jeżeli stosuje się Oligo dT lub specyficzne startery, reakcję należy prowadzić w temperaturze 50°C przez 30~60 minut.
5.Ogrzewać w temperaturze 95°C przez 5 minut, aby inaktywować odwrotną transkryptazę Neoscript i zakończyć reakcję.
6.Produkty odwrotnej transkrypcji można stosować bezpośrednio w reakcji PCR i fluorescencyjnej ilościowej reakcji PCR lub przechowywać przez długi czas w temperaturze -20 ℃.
PCR Rreakcja:
1.Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej
| składniki | Stężenie |
| 10 × bufor do PCR (wolny od dNTP, bez Mg²+) | 1× |
| dNTP (10 mM każdy dNTP) | 200 µM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Polimeraza DNA Taq (5U/μL) | 2-2,5 jednostki |
| Podkład 1 (10 µM) | 0,2-1 µM |
| Podkład 2 (10 µM) | 0,2-1 µM |
| SzablonA | ≤10% Roztwór pierwszej reakcji łańcuchowej (2 μL) |
| ddH2O | Do 50 µl |
Uwagi:a: Jeśli dodana zostanie zbyt duża ilość roztworu pierwszej reakcji łańcuchowej, reakcja PCR może zostać zahamowana.
2.Procedura reakcji PCR
| Krok | Temperatura | Czas | Cykle |
| Wstępna denaturacja | 95 ℃ | 2-5 minut | 1 |
| Denaturacja | 95 ℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Wyżarzanie | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Rozszerzenie | 72 ℃ | 10-60 sek |
Notatki
1.Nadaje się do optymalizacji temperatury odwrotnej transkrypcji w zakresie 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Ma lepszą stabilność, nadaje się do amplifikacji odwrotnej transkrypcji w wysokiej temperaturze.Ponadto sprzyja efektywnemu przejściu przez złożone regiony strukturalne RNA.Także tonadaje się do jednoetapowej ilościowej detekcji RT-PCR metodą multipleksowej fluorescencji.
3.Dobra kompatybilność z różnymi enzymami do amplifikacji PCR i nadaje się do reakcji RT-PCR o wysokiej czułości.
4.Nadaje się do jednoetapowej ilościowej reakcji RT-PCR o wysokiej czułości, skutecznie poprawiając współczynnik wykrywalności niskich stężeń matryc.
5.Nadaje się do konstrukcji biblioteki cDNA.
