Uniwersalny Premiks SYBR GREEN qPCR (Niebieski)
Nr kat.: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (Dye Based) to roztwór wstępny do 2× ilościowej amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym, charakteryzujący się wysoką czułością i specyficznością, ma niebieski kolor i umożliwia śledzenie dodatku próbki.Podstawowy składnik, polimeraza DNA Taq, wykorzystuje przeciwciało typu „gorący start” do skutecznego hamowania nieswoistej amplifikacji w wyniku przyłączania startera podczas przygotowywania próbki.Jednocześnie formuła dodaje czynniki promujące, aby poprawić wydajność amplifikacji reakcji PCR i wyrównać amplifikację genów o różnej zawartości GC (30 ~ 70%), dzięki czemu ilościowa PCR może uzyskać dobrą zależność liniową w szerokim zakresie ilościowym region.Ten produkt zawiera specjalny pasywny barwnik referencyjny ROX, który można zastosować w większości urządzeń qPCR.Nie jest konieczne dostosowywanie stężenia ROX na różnych instrumentach.Konieczne jest jedynie dodanie starterów i matryc w celu przygotowania układu reakcyjnego do amplifikacji.
składniki
Mieszanka Master Mix Universal Blue qPCR
Warunki przechowywania
Produkt jest dostarczany z okładami z lodu i można go przechowywać w temperaturze -25 ℃ ~ -15 ℃ przez 18 miesięcy.Podczas przechowywania lub przygotowywania układu reakcyjnego należy unikać silnego napromieniowania światłem.
Specyfikacja
| Stężenie | 2× |
| Metoda wykrywania | SYBR |
| Metoda PCR | qPCR |
| Polimeraza | Polimeraza DNA Taq |
| Rodzaj próbki | DNA |
| Sprzęt aplikacyjny | Większość instrumentów qPCR |
| Rodzaj produktu | Premiks SYBR do ilościowego fluorescencyjnego PCR w czasie rzeczywistym |
| Aplikuj do (aplikacji) | Ekspresja genu |
Instrukcje
1. Układ reakcyjny
| składniki | Objętość (μL) | Objętość (μL) | Końcowe stężenie |
| Uniwersalny premiks SYBR GREEN qPCR | 25 | 10 | 1× |
| Podkład do przodu (10 μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2 μmol/l |
| Podkład odwrotny (10 μmol/L) | 1 | 0,4 | 0,2 μmol/l |
| DNA | X | X | |
| ddH2O | do 50 | do 20 | - |
[Uwaga]: Dokładnie wymieszaj przed użyciem, aby uniknąć nadmiernych pęcherzyków w wyniku energicznego wstrząsania.
a) Stężenie startera: Końcowe stężenie startera wynosi 0,2 μmol/L i można je również regulować w zakresie od 0,1 do 1,0 μmol/L, stosownie do potrzeb.
b) Stężenie matrycy: Jeżeli matrycą jest nierozcieńczony roztwór podstawowy cDNA, zastosowana objętość nie powinna przekraczać 1/10 całkowitej objętości reakcji qPCR.
c) Rozcieńczenie szablonu: Zaleca się rozcieńczenie roztworu podstawowego cDNA 5-10 razy.Optymalna ilość dodanej matrycy jest lepsza, gdy wartość Ct uzyskana w wyniku amplifikacji wynosi 20-30 cykli.
d) Układ reakcyjny: Zaleca się użycie 20 μL lub 50 μL, aby zapewnić skuteczność i powtarzalność amplifikacji genu docelowego.
e) Przygotowanie systemu: Proszę przygotować na super czystym stole i używać końcówek i probówek reakcyjnych bez pozostałości nukleaz;zaleca się stosowanie końcówek z wkładami filtrującymi.Unikać zanieczyszczenia krzyżowego i zanieczyszczenia aerozolem.
2.Program reakcji
Program standardowy
| Krok cyklu | Temp. | Czas | Cykle |
| Początkowa denaturacja | 95 ℃ | 2 min | 1 |
| Denaturacja | 95 ℃ | 10 sek | 40 |
| Wyżarzanie/Wydłużanie | 60 ℃ | 30 sekund★ | |
| Etap krzywej topnienia | Domyślne ustawienia instrumentu | 1 | |
Szybki program
| Krok cyklu | Temp. | Czas | Cykle |
| Początkowa denaturacja | 95 ℃ | 30 sek | 1 |
| Denaturacja | 95 ℃ | 3 sek | 40 |
| Wyżarzanie/Wydłużanie | 60 ℃ | 20 sekund★ | |
| Etap krzywej topnienia | Domyślne ustawienia instrumentu | 1 | |
[Uwaga]: Szybki program jest odpowiedni dla zdecydowanej większości genów, a programy standardowe można wypróbować dla poszczególnych genów o złożonej strukturze drugorzędowej.
a) Temperatura i czas wyżarzania: Proszę dostosować w zależności od długości startera i genu docelowego.
b) Akwizycja sygnału fluorescencji (★): Proszę ustawić procedurę eksperymentalną zgodnie z wymaganiami zawartymi w instrukcji obsługi urządzenia.
c) Krzywa topnienia: Można normalnie używać domyślnego programu urządzenia.
3. Analiza wyników
Do eksperymentów ilościowych wymagane były co najmniej trzy repliki biologiczne.Po reakcji należy potwierdzić krzywą amplifikacji i krzywą topnienia.
3.1 Krzywa wzmocnienia:
Standardowa krzywa wzmocnienia ma kształt litery S.Analiza ilościowa jest najdokładniejsza, gdy wartość Ct mieści się w przedziale 20–30. Jeżeli wartość Ct jest mniejsza niż 10, konieczne jest rozcieńczenie matrycy i ponowne przeprowadzenie testu.Gdy wartość Ct mieści się w przedziale 30-35, konieczne jest zwiększenie stężenia matrycy lub objętości układu reakcyjnego, aby poprawić wydajność amplifikacji i zapewnić dokładność analizy wyników.Gdy wartość Ct jest większa niż 35, wyniki testu nie mogą ilościowo analizować ekspresji genu, ale można je wykorzystać do analizy jakościowej.
3.2 Krzywa topnienia:
Pojedynczy pik na krzywej topnienia wskazuje, że specyficzność reakcji jest dobra i można przeprowadzić analizę ilościową;jeżeli krzywa topnienia wykazuje podwójne lub wielokrotne piki, nie można przeprowadzić analizy ilościowej.Krzywa topnienia pokazuje podwójne piki i należy ocenić, czy pik inny niż docelowy jest dimerem startera, czy nieswoistą amplifikacją metodą elektroforezy DNA w żelu agarozowym.Jeśli jest to dimer startera, zaleca się zmniejszenie stężenia startera lub przeprojektowanie starterów z wysoką wydajnością amplifikacji.Jeśli jest to amplifikacja niespecyficzna, należy zwiększyć temperaturę wyżarzania lub przeprojektować startery pod kątem specyficzności.
Notatki
Aby zapewnić sobie zdrowie i bezpieczeństwo, należy nosić niezbędne środki ochrony indywidualnej, takie jak fartuch laboratoryjny i rękawiczki!
Ten produkt jest przeznaczony WYŁĄCZNIE do celów badawczych!
