Zestaw do bezpośredniego PCR Plant

Nr kat.: HCR2020A

Zestaw Plant Direct PCR nadaje się do bezpośredniej amplifikacji liści roślin, nasion itp. i może być stosowany do wysokowydajnego badania przesiewowego próbek roślin niezawierających polisacharydów i polifenoli.Polimeraza DNA z bezpośrednią amplifikacją, oparta na ukierunkowanej ewolucji, ma lepszą tolerancję na inhibitory PCR w roślinach.Tymczasem utrzymuje wysoką wydajność amplifikacji, która jest odpowiednia do amplifikacji fragmentów DNA w promieniu 5 kb.Unikalny bufor do lizy A znajdujący się w zestawie może być używany do lizy świeżych lub mrożonych tkanek roślinnych.Jest łatwy w obsłudze, a lizat można wykorzystać jako matrycę do amplifikacji bez oczyszczania.System zawiera środki zabezpieczające, które umożliwiają skuteczną amplifikację surowych próbek po wielokrotnym zamrażaniu i rozmrażaniu.2 × Plant Direct Master Mix wymaga jedynie dodania starterów i matryc, aby przeprowadzić reakcję amplifikacji, redukując w ten sposób liczbę operacji pipetowania i poprawiając wydajność wykrywania i powtarzalność wyników.

składniki

*Plant Direct Lysis Buffer B to opcjonalny odczynnik używany do neutralizacji Plant Direct Lysis Buffer A w celu przedłużenia czasu przechowywania próbek.Można go używać w zależności od rzeczywistej sytuacji.

Warunki przechowywania

2 × Plant Direct Master Mix, przechowywać w temperaturze -30 ~ -15℃ i unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania;Bufor do bezpośredniej lizy roślinnej, przechowuj w temperaturze -30 ~ -15 ℃ lub 2 ~ 8 ℃.

Proces eksperymentu

Przetwarzanie próbek–Liść Rośliny

Metoda bezpośrednia:Zaleca się stosowanie młodych liści.Użyj dziurkacza o stałej średnicy 0,5 – 3 mm, aby uzyskać małą i jednolitą próbkę, a następnie dodaj próbkę bezpośrednio do systemu PCR (zalecany jest system 50 μl).Uwaga, upewnij się, że próbka znajduje się w roztworze PCR, a nie przy ściance probówki.Jeżeli do amplifikacji długich fragmentów i złożonych próbek stosuje się bezpośrednią reakcję PCR, zastosowanie próbki o mniejszej średnicy (0,5–1 mm) jako matrycy może pomóc w uzyskaniu lepszych wyników.

Metoda lizy mielenia:Zaleca się stosowanie młodych liści.Weź mały kawałek liścia (o średnicy około 1 – 3 mm), umieść go w 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab i zmiel go tak bardzo, jak to możliwe (ten etap można wykonać ściskając liść końcówką pipety 100 μl rozdrobnić próbkę).W przypadku użycia większej objętości tkanki liścia (nie przekraczającej 7 mm) objętość buforu do rozcieńczania należy zwiększyć do 50 µl.Po zmieleniu liści roztwór powinien wyglądać na zielony.Po krótkim odwirowaniu dodać 1 µl supernatantu do układu PCR jako matrycę reakcjic.

Metoda lizy termicznej:Zaleca się stosowanie młodych liści.Weź mały kawałek liścia (o średnicy około 1 – 3 mm), umieść go w 20 μl buforu do lizy Plant Direct Lysis Buffer A i podgrzewaj w temperaturze 95°C przez 5 – 10 minut.W przypadku liści trudnych do lizy czas lizy można odpowiednio wydłużyć (nie więcej niż 20 min).Jeżeli stosuje się większe objętości tkanki liści (nie przekraczające 7 mm), należy zwiększyć objętość buforu do rozcieńczania do 50 µl.Po ogrzaniu krótko odwirować i dodać 1 µl supernatantu do układu PCR jako matrycę reakcjib.

Przetwarzanie próbek–Nasiona roślin

Metoda lizy mielenia:Skalpelem wytnij nasiona o średnicy 5 mm, dodaj je do 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A i rozdrobnij próbkę końcówką pipety lub innym narzędziem.Krótko wymieszaj i odstaw w temperaturze pokojowej na 3 – 5 minut.Upewnij się, że próbka nasion jest zanurzona w buforze do rozcieńczania.Po krótkim odwirowaniu dodać 1 µl supernatantu do układu PCR jako matrycę reakcji.

Metoda lizy termicznej:Skalpelem wytnij nasiona o średnicy 5 mm, dodaj je do 100 μl buforu Plant Direct Lysis Buffer A i podgrzewaj w temperaturze 95°C przez 5 – 10 min.W przypadku liści trudnych do lizy czas lizy można odpowiednio wydłużyć (nie więcej niż 30 min).Po ogrzaniu krótko odwirować i dodać 1 µl supernatantu do układu PCR jako matrycę reakcyjnąb.

A.Do wycięcia próbek o odpowiedniej wielkości można również użyć nożyczek lub innych narzędzi;w przypadku ponownego użycia stempla lub nożyczek należy przed każdym użyciem oczyścić je 2% roztworem podchlorynu sodu, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu próbek.

B.Przed użyciem należy upewnić się, że bufor do lizy Plant Direct jest całkowicie stopiony.Jeżeli bufor jest lepki lub wytrąca się osad, można go przed użyciem podgrzać do temperatury 37°C w celu całkowitego stopienia.

C.Objętość matrycy w układzie reakcyjnym można odpowiednio dostosować w zależności od różnicy w objętości materiału roślinnego i dodanego rozcieńczalnika.

Roślinny bufor do bezpośredniej lizy

Bufor A do bezpośredniej lizy roślin zawarty w tym produkcie został ściśle zoptymalizowany pod kątem uwolnienia genomu większości tkanek roślinnych i nadaje się do krótkotrwałego przechowywania surowych roślin w temperaturze 4 ℃.Jeżeli próbka wymaga dłuższego przechowywania (np. 1 – 2 miesiące), zaleca się przeniesienie supernatantu do nowej probówki EP i przechowywanie go w temperaturze -20℃.Aby przechowywać próbki stabilniej, dodaj równą objętość buforu Plant Direct Lysis Buffer B do przeniesionego supernatantu, dobrze wymieszaj i przechowuj w temperaturze -20°C.Stabilny czas przechowywania różni się w zależności od próbek i stanów roślin.

Układ reakcji

A.Zawiera Mg²⁺w końcowym stężeniu 2 mM.

B.Zaleca się stosowanie końcowego stężenia 0,4 µM dla każdego startera.Nadmierne użycie starterów będzie prowadzić do zwiększonej nieswoistej amplifikacji.

C.Ilość użytej próbki można dostosować do aktualnej sytuacji.Ilość użytej w pojedynczej reakcji surowej, zlizowanej próbki można regulować w zakresie od 2% do 20% całkowitej objętości reakcji.Użycie zbyt dużej liczby próbek może spowodować niepowodzenie amplifikacji.

Program reakcji

A.Początkowa denaturacja (98°C, 5 min) sprzyja lizie tkanki roślinnej, uwalniając genomowy DNA, który można wykorzystać do amplifikacji PCR.Nie skracaj czasu i nie obniżaj temperatury.

B.Zaleca się ustawienie go na wartość Tm podkładu lub o 2 ~ 4℃ wyższą niż wartość Tm.Polimeraza DNA do bezpośredniej amplifikacji zastosowana w tym produkcie różni się od konwencjonalnej polimerazy DNA Taq i ma specjalne wymagania dotyczące temperatury przyłączania reakcji; zastosowanie wysokiej temperatury przyłączania może skutecznie zmniejszyć niespecyficzną amplifikację i poprawić wydajność amplifikacji.W przypadku złożonych szablonów wydajną amplifikację można osiągnąć, dostosowując temperaturę wyżarzania i wydłużając czas wydłużania.

C.Jeżeli długość produktu amplifikacji wynosi ≤ 1 kb, czas wydłużania ustala się na 30 s/kb;jeżeli długość produktu amplifikacji wynosi > 1 kb, czas wydłużania ustala się na 60 s/kb.

D.W przypadku próbek złożonych lub próbek o niskiej wydajności amplifikacji liczbę cykli można odpowiednio zwiększyć do 40 -50 cykli.

Aplikacje

Ma zastosowanie do bezpośredniej amplifikacji tkanek roślinnych i wysokowydajnego badania przesiewowego próbek roślin niezawierających polisacharydów i polifenoli.

Notatki

Tylko do użytku badawczego.Nie do stosowania w procedurach diagnostycznych.

1. W przypadku amplifikacji surowych roślin lub amplifikacji bezpośredniej zaleca się użycie oczyszczonego genomowego DNA jako kontroli pozytywnej przed rozpoczęciem doświadczenia, aby upewnić się, że system, startery i operacje są prawidłowe.

2. Polimeraza DNA do bezpośredniej amplifikacji zastosowana w tym zestawie ma silne działanie korygujące.Jeśli konieczne jest wykonanie klonowania TA, zaleca się oczyszczenie DNA przed dodaniem adeniny.

3. Wytyczne dotyczące projektowania podkładu:

A.Zaleca się, aby ostatnia zasada na końcu 3' startera miała oznaczenie G lub C.

B.Należy unikać kolejnych niedopasowań w ostatnich 8 zasadach na końcu 3' startera.C.Unikaj struktur typu spinka do włosów na końcu 3′ podkładu.

D.Różnice w wartości Tm startera przedniego i startera wstecznego nie powinny przekraczać 1℃, a wartość Tm powinna wynosić 60 ~ 72℃ (do obliczenia wartości Tm zaleca się Primer Premier 5).

mi.Dodatkowe dodatkowe sekwencje starterów, które nie są dopasowane do matrycy, nie powinny być uwzględniane przy obliczaniu wartości Tm startera.

F.Zaleca się, aby zawartość GC w starterze wynosiła 40% -60%.

G.Ogólny rozkład A, G, C i T w podkładzie powinien być możliwie równomierny.Unikaj używania regionów o wysokiej zawartości GC lub AT.

H.Unikaj obecności komplementarnych sekwencji 5 lub więcej zasad w obrębie startera lub pomiędzy dwoma starterami i unikaj obecności komplementarnych sekwencji 3 lub więcej zasad na końcu 3' dwóch starterów.

I.Użyj funkcji NCBI BLAST, aby sprawdzić specyficzność startera, aby zapobiec nieswoistej amplifikacji.