Glikozylaza DNA uracylu
Glikozylaza uracyl-DNA (UNG lub UDG) jest rekombinowanym klonem E.coli o masie cząsteczkowej 25 kDa.Katalizuje uwalnianie wolnego uracylu z jednoniciowego i dwuniciowego DNA zawierającego uracyl i jest nieaktywny wobec RNA i może być stosowany w celu zapobiegania zanieczyszczeniu produktów amplifikacji PCR.Zasada działania polega na tym, że jeśli w reakcji PCR zamiast dTTP zastąpi się dUTP i powstanie produkt amplifikacji PCR zawierający zasady dU, enzym może selektywnie rozrywać wiązanie glikozydowe zasad U w strukturach jednoniciowych i dwuniciowych DNA i degradują produkt amplifikacji PCR.
Zalecana aplikacja
Wzmocnienie zapobiegania zanieczyszczeniom
Stan przechowywania
-20°C w przypadku długotrwałego przechowywania, należy dobrze wymieszać przed użyciem, unikać częstego zamrażania i rozmrażania.
Bufor do przechowywania
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilizator, 50% gliceryny.
Definicja jednostki
Ilość enzymu potrzebna do rozkładu 1 µg jednoniciowego DNA zawierającego zasady dU w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C wynosi 1 jednostkę.
Kontrola jakości
1.Czystość elektroforetyczna SDS-PAGE większa niż 98%
2.Czułość amplifikacji, kontrola między partiami, stabilność
3.Po obróbce 1U UNG w temperaturze 50°C przez 2 minuty matryca zawierająca U poniżej 103 kopii powinna ulec całkowitemu rozkładowi i nie może zostać wytworzony żaden produkt amplifikacji
4.Brak aktywności egzogennej nukleazy
Instrukcje
| składniki | Objętość (µL) | Końcowe stężenie |
| 10 × bufor do PCR (wolny od dNTP, Mg²+bezpłatny) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 µM |
| dUTP (zastąp dTTP) | - | 200-600 µM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 µl | 1-4 mM |
| 5 U/μL Tak | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/µL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Mieszanka podkładowaA | 2 | 1× |
| Szablon | - | ＜1 µg/reakcję |
| ddH₂O | Do 50 | - |
Notatka: a: Jeśli jest używana do qPCR/qRT-PCR, do układu reakcyjnego należy dodać sondę fluorescencyjną.Zwykle końcowe stężenie startera wynoszące 0,2 µM może dać dobre wyniki;gdy przebieg reakcji jest słaby, stężenie startera można regulować w zakresie 0,2-1 µM.Zwykle stężenie sondy optymalizuje się w zakresie 0,1-0,3 µM.Aby znaleźć najlepszą kombinację startera i sondy, można przeprowadzić eksperymenty z gradientem stężeń.
Notatki
1.Enzymu UNG można użyć do usunięcia zanieczyszczonych produktów amplifikacji dUTP z układu reakcyjnego przed reakcją amplifikacji PCR, a następnie w celu uniknięcia fałszywie dodatnich wyników z powodu zanieczyszczenia produktu.
2.Optymalna temperatura dla enzymu UNG stosowanego w reakcji PCR zapobiegającej zanieczyszczeniu wynosi zazwyczaj 50 ℃ przez 2 minuty;warunek inaktywacji wynosi 95 ℃ przez 5 minut.
3.Unikaj częstego zamrażania i rozmrażania oraz nie wystawiaj na duże wahania temperatury.
4.Różne geny przeznaczone do amplifikacji charakteryzują się różną wydajnością wykorzystania dUTP i wrażliwością na enzym UNG, dlatego jeśli zastosowanie systemu UNG prowadzi do zmniejszenia czułości detekcji, należy dostosować i zoptymalizować układ reakcji. W razie potrzeby wsparcia technicznego prosimy o kontakt nasza firma.
