Superstart qPCR Premiks plus-UNG
Nr kat.: HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG to specjalistyczny odczynnik przeznaczony do jakościowych i ilościowych reakcji Real Time PCR z wykorzystaniem detekcji opartej na sondzie, opracowany specjalnie do procesów liofilizacji.Zawiera nowatorski enzym gorącego startu Hotstart Taq plus (DG), którego aktywność enzymatyczna Taq jest zamknięta w temperaturze pokojowej, skutecznie hamując nieswoistą amplifikację spowodowaną nieswoistym przyłączaniem startera lub tworzeniem dimeru startera w warunkach niskiej temperatury, poprawiając w ten sposób specyficzność reakcji amplifikacji.Odczynnik ten wykorzystuje zoptymalizowany bufor specyficzny dla qPCR i system zapobiegający zanieczyszczeniom UNG/dUTP, aby zapewnić szybki start na gorąco, znacznie poprawiając wydajność i czułość reakcji qPCR.Może uzyskiwać dobre krzywe standardowe w szerokim zakresie obszarów oznaczania ilościowego i dokładnie przeprowadzać oznaczanie ilościowe, skutecznie zapobiegając fałszywie dodatniej amplifikacji spowodowanej resztkowymi produktami PCR lub zanieczyszczeniem aerozolem.Odczynnik ten jest kompatybilny z większością fluorescencyjnych urządzeń do ilościowego PCR takich producentów jak Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad i Roche itp. i wykazuje dobrą stabilność w postaci liofilizowanej.
Skład odczynnika
1. 5×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+bezpłatnie) (DG)
2. 250 mM MgCl2
3. 4×lioprotektant (opcjonalnie)
Warunki przechowywania
Długotrwałe przechowywanie w -20℃;można przechowywać w temperaturze 4℃ przez okres do 3 miesięcy.Dobrze wymieszać przed użyciem iunikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
Protokół rowerowy
| Procedura | Temp. | Czas | Cykl |
| Trawienie | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Aktywacja polimerazy | 95 ℃ | 1 ~ 5 minut | 1 |
| Denaturować | 95 ℃ | 10 ~ 20 s | 40-50 |
| Wyżarzanie i rozciąganie | 56 ~ 64 ℃ | 20 ~ 60 s | 40-50 |
qPCR Liquid Reaction SyPrzygotowanie łodygi
|
Kompozycja |
Objętość 25 µl |
Objętość 50 µl |
Końcowe stężenie |
| 5×HotstartPremix plus-UNG(Mg2+bezpłatnie) (DG) | 5µL | 10µL | 1× |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µl | 0,9 µl | 4,5 mM |
| 4×lioprotektant1 | 6,25 µl | 12,5 µl | 1× |
| 25×Mieszanka gruntu i sondy2 | 1µL | 2µL | 1× |
| Szablon DNA3 | —— | —— | —— |
| ddH2O | Do 25µl | Do 50µl | —— |
1. Końcowe stężenie starterów wynoszące 0,2 μM zwykle daje dobre wyniki;gdy wydajność reakcji jest słaba, w razie potrzeby wyreguluj stężenie startera w zakresie 0,2-1 μM.Stężenie sondy jest zwykle optymalizowane w zakresie 0,1–0,3 μM poprzez eksperymenty gradientowe w celu znalezienia optymalnych kombinacji.
2. Liczba kopii genów docelowych zawartych w różnych typach matryc jest różna;jeśli to konieczne, można przeprowadzić rozcieńczenie gradientowe w celu określenia optymalnej ilości dodanej matrycy.
3. Układ ten można liofilizować;gdy klienci korzystają z tego systemu bez wymagań dotyczących liofilizacji, można selektywnie dodać 4 x lioprotektant; jeśli wymagane są produkty liofilizowane, podczas sprawdzania działania produktu na etapie ciekłych odczynników, należy dodać 4 x lioprotektant, aby zapewnić spójność z liofilizowanymi składnikami systemu i efekty.
Kiedy system jest używanyd do liofilizacji, przygotować system as następny:
| Kompozycja | 25µl Układ reakcji |
| 5 ×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+bezpłatnie) (DG) | 5µL |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µl |
| 4×lioprotektant | 6,25 µl |
| 25×Mieszanka gruntu i sondy | 1µL |
| ddH2O | Do 18~20µl |
* Jeśli potrzebne są inne systemy do liofilizacji, należy skonsultować się osobno.
Proces liofilizacjiss
| Procedura | Temp. | Czas | Stan | Ciśnienie |
| Wstępne zamrażanie | 4℃ | 30 minut | Trzymać |
1 atm |
| -50 ℃ | 60 minut | Chłodzenie | ||
| -50 ℃ | 180 minut | Trzymać | ||
| Pierwotne suszenie | -30 ℃ | 60 minut | Ogrzewanie |
Ostateczna próżnia |
| -30 ℃ | 70 minut | Trzymać | ||
| Suszenie wtórne | 25 ℃ | 60 minut | Ogrzewanie |
Ostateczna próżnia |
| 25 ℃ | 300 minut | Trzymać |
2. Powyższy proces liofilizacji ma charakter wyłącznie informacyjny.Różne rodzaje produktów i różne liofilizatory mają różne parametry, dlatego można dokonać regulacji w zależności od rzeczywistychwarunkach podczas użytkowania.
3. Dla różnych wielkości partii liofilizowanych mogą być odpowiednie różne procesy liofilizacjiproduktów, dlatego w przypadku stosowania w produkcji na dużą skalę należy przeprowadzić odpowiednią walidację testów.
Instrukcja stosowania liofilizuproszek
1. Krótko odwiruj liofilizowany proszek;
2. Do liofilizowanego proszku dodać matrycę kwasu nukleinowego i dodać wodę do objętości 25µL;
3. Dobrze wymieszaj przez odwirowanie i przepuść przez maszynę.
Kontrola jakości:
1. Testy funkcjonalne: czułość, swoistość, odtwarzalność qPCR.
2. Brak aktywności egzogennej nukleazy, brak zanieczyszczenia egzogenną endo/egzonukleazą.
Specyfikacja:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG wykorzystuje nowatorski enzym gorącego startu, który umożliwia szybki rozruch na gorąco w ciągu 1–5 minut;dzięki specjalnej formule buforu nadaje się do multipleksowych fluorescencyjnych ilościowych reakcji PCR.
2. Ma wyższą specyficzność, co znacząco poprawia czułość wykrywania limitu ilościowego fluorescencji PCR, dzięki czemu normalizacja krzywych amplifikacji, wartość fluorescencji uzyskuje oczywistą poprawę przy matrycach o niskim stężeniu, odpowiednich jako odczynniki do ilościowego wykrywania fluorescencji PCR o wysokiej czułości.
3. W przypadku starterów o niższej temperaturze przyłączania lub fragmentów dłuższych niż 200 bp zalecana jest metoda 3-etapowa.
4. Efektywność wykorzystania dUTP i czułość na enzym UNG są różne dla różnych genów docelowych, zatem jeśli zastosowanie systemu UNG prowadzi do zmniejszenia czułości detekcji, należy dostosować i zoptymalizować układ reakcji.Jeżeli potrzebne jest wsparcie techniczne prosimy o kontakt z naszą firmą.
5. Przed i po amplifikacji należy używać przeznaczonych do tego miejsc i pipet, podczas pracy nosić rękawiczki i często je wymieniać;nie otwierać probówki reakcyjnej po zakończeniu PCR, aby zminimalizować zanieczyszczenie próbek produktami PCR.
