Minizestaw do ekstrakcji DNA
Zestaw ten wykorzystuje zoptymalizowany układ buforowy i technologię oczyszczania kolumnowego z żelem krzemionkowym, która umożliwia odzyskanie fragmentów DNA o wielkości od 70 bp do 20 kb z żelu agarozowego TAE lub TBE o różnym stężeniu.Kolumna adsorpcyjna DNA może specjalnie adsorbować DNA w warunkach wysokiej zawartości soli.Ponadto zestaw może bezpośrednio oczyścić fragmenty DNA z produktów PCR, układów reakcji enzymatycznych lub surowych produktów DNA otrzymanych innymi metodami oraz usunąć zanieczyszczenia takie jak białka, inne związki organiczne, jony soli nieorganicznych i startery oligonukleotydowe.Może zapewnić, że oczyszczanie zostanie zakończone w ciągu 10-15 minut.Oczyszczone DNA można zastosować bezpośrednio do ligacji, transformacji, trawienia enzymatycznego, transkrypcji in vitro, PCR, sekwencjonowania, mikroiniekcji itp.
Warunki przechowywania
Przechowywać w temperaturze -15 ~ -25℃ i transportować w temperaturze pokojowej.
składniki
| składniki | (100 rxns) |
| Bufor PKB | 80ml |
| Bufor GW | 2 × 20ml |
| Bufor do elucji | 20 ml |
| Minikolumny FastPure DNA-G | 100 |
Bufor PKB:Bufor wiążący DNA.
Bufor GW:Bufor płuczący;przed użyciem dodać etanol absolutny w ilości wskazanej na butelce.
Bufor do elucji:Elucja.
Minikolumny FastPure DNA-G:Kolumny adsorpcyjne DNA.
Kolekcja Tuby 2 ml:Probówki zbierające filtrat.
Przygotowane materiały
1,5 ml wysterylizowanych probówek, etanol absolutny i izopropanol (w przypadku fragmentu DNA ≤100 bp dodać 1 objętość
izopropanol na 1 objętość żelu), łaźnia wodna.
Proces eksperymentu
Przed użyciem dodać 80 ml etanolu w celu rozcieńczenia buforu Buffer GW zgodnie z informacją na etykiecie, przechowywać w temperaturze pokojowej.
Mechanizm
1. Roztwór do reakcji PCR
Schemat ekstrakcji żelowej:Dodaj równą objętość buforu PKBPCR.Schemat odzyskiwania roztworu reakcyjnego:Dodać 5-krotną objętość buforu
2. PKB Oblicz objętość żelu (100 μl równa się 100 mg)
Rozpuścić żel
3. Rozgrzej w temperaturze 50 ~ 55℃
4. Zwiąż pranie
Dodaj 300 µl buforu PKB*
Dodać 700 µl buforu GW
Dodać 700 µl buforu GW
5. Eluować
Dodać 20 – 30 µl buforu do elucji lub wody dejonizowanej
Uwagi* Odzyskiwanie płynu po reakcji PCR bez tego etapu
Program ekstrakcji żelu
1. Po elektroforezie DNA w celu frakcjonowania fragmentów DNA wytnij pojedynczy pasek fragmentu DNA z żelu agarozowego w świetle UV.Zaleca się użycie bibuły chłonnej w celu wchłonięcia pozornej wilgoci żelu i zminimalizowania rozmiaru plasterka żelu poprzez usunięcie nadmiaru agarozy w miarę możliwości.Zważ plaster żelu (bez probówki do mikrowirówki), aby obliczyć jego objętość: Objętość plasterka żelu o masie 100 mg wynosi około 100 μl, zakładając, że gęstość wynosi 1 g/ml.
2. Dodaj taką samą objętość buforu PKB, inkubuj w temperaturze 50~55℃ przez 7-10 minut (w zależności od wielkości żelu, dostosuj czas inkubacji aż do całkowitego rozpuszczenia żelu).Podczas inkubacji odwrócić probówkę 2 razy.
Δ Dodanie 1-3 objętości buforu Buffer PKB nie będzie miało wpływu na skuteczność odzyskiwania DNA.Jeżeli fragment DNA przeznaczony do odzyskania jest < 100 bp, należy dodać 3 objętości Buffer PKB;gdy plasterek żelu całkowicie się rozpuści, dodać 1 objętość izopropanolu i dokładnie wymieszać, po czym przejść do następnego kroku.
3. Krótko odwiruj, aby próbka opadła na dno probówki, włóż FastPure DNA Mini Columns-G do probówek zbierających 2 ml, ostrożnie przenoś roztwór maksymalnie w ilości 700 μL raz na
czas do kolumn filtracyjnych, wirować przy 12 000 obr/min (13 800 X g) przez 30-60 sek.
4. Odrzucić przesącz i dodać do kolumny 300 µl buforu Buffer PKB, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min, wirować przy 12 000 obr/min (13 800 X g) przez 30-60 sek.
5. Wyrzucić przesącz i dodać do kolumny 700 µl Buffer GW (sprawdź wcześniej, czy dodano absolutny etanol!) na kolumnę, wirować przy 12 000 obr/min (13 800 X g) przez 30-60 sek.
Δ Proszę dodać bufor Buffer GW wokół ścianki kolumny adsorpcyjnej lub dodać tylną pokrywę buforu Buffer GW i wymieszać do góry nogami 2 – 3 razy, aby całkowicie wypłukać sól przylegającą do ścianek rurki.
6. Powtórz krok 5.
Δ Dwukrotne przepłukanie buforem GW może zapewnić całkowite usunięcie soli i wyeliminować jej wpływ na kolejne doświadczenia.
7. Wyrzucić przesącz i wirować pustą kolumnę przy 12 000 obr/min (13 800 X g) przez 2 min.
8. Włóż kolumnę do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, dodaj 20 - 30 μl buforu do elucji na środek membrany kolumny, inkubuj przez 2 minuty, a następnie wiruj przy 12 000 obr./min (13 800 X g) przez 1 minutę.Wyrzucić kolumnę, przechowywać otrzymane DNA w temperaturze -20°C.
Δ Przeniesienie supernatantu z etapu 8 na kolumnę w celu ponownej elucji i wstępne podgrzanie buforu elucyjnego do 55°C (kiedy fragment DNA > 3 kb) może być pomocne w zwiększeniu wydajności odzyskiwania.
Program odzyskiwania produktów PCR
Protokół ten ma zastosowanie do oczyszczania fragmentów DNA z produktów PCR, układów reakcji enzymatycznych i innych surowych produktów DNA (w tym DNA genetycznego).Roztwór ten może skutecznie usuwać różne nukleotydy, startery, dimery starterów, cząsteczki soli, enzymy i inne zanieczyszczenia.
1. Krótko odwiruj produkty PCR, roztwór reakcji enzymatycznej i inne surowe produkty DNA.Oszacuj ich objętość za pomocą pipety i przenieś do wysterylizowanej probówki o pojemności 1,5 ml lub 2 ml.Dodać ddH2O do objętości 100 µl;natomiast w przypadku genomowego DNA o wysokim stężeniu rozcieńczenie ddH2O do 300 µl pomoże poprawić skuteczność odzyskiwania.
2. Dodać 5 objętości Buffer PKB, dokładnie wymieszać poprzez odwrócenie lub worteksowanie.Jeśli interesujący fragment DNA > 100 bp, należy dodać dodatkowe 1,5 objętości (próbki + bufor PKB) etanolu.
3. Włóż kolumnę z powrotem do probówki zbiorczej, przenieś mieszaninę na kolumnę, wiruj przy 12 000 obr./min (13 800 × g) przez 30 – 60 sek.Jeżeli objętość wymieszanego roztworu wynosi >700 µl, włóż kolumnę adsorpcyjną z powrotem do probówki zbiorczej, przenieś pozostały roztwór do kolumny adsorpcyjnej i wiruj przy 12 000 obr./min (13 800 × g) przez 30 – 60 sek.
4. Kolejne wykonanie dotyczy kroków 5 – 8 z 08-1/programu ekstrakcji żelowej.
Aplikacje
Różne stężenia żelu agarozowego TAE lub TBE;Produkty PCR, układy reakcji enzymatycznych lub inne surowe produkty DNA otrzymywane różnymi metodami.Odzyskane fragmenty obejmowały m.in70 pz -20 kb.
Notatki
Tylko do użytku badawczego.Nie do stosowania w procedurach diagnostycznych.
1. Przed użyciem dodać 80 ml etanolu w celu rozcieńczenia buforu Buffer GW zgodnie ze wskazaniami na etykiecie, przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Jeżeli bufor PKB łatwo wytrąca się podczas przechowywania w niskiej temperaturze, przed użyciem można go umieścić na pewien czas w temperaturze pokojowej.W razie potrzeby można go podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37℃ do całkowitego rozpuszczenia osadu, a następnie po wymieszaniu można go używać.
3. Ustaw wcześniej temperaturę łaźni wodnej na 50 ~ 55 ℃.
4. W kroku 1 programu ekstrakcji 08-1/Gel zminimalizowanie rozmiaru plasterka żelu znacznie skróci czas rozpuszczania i zwiększy wydajność odzyskiwania (linearyzowany DNA łatwo ulega hydrolizie, gdy jest stale wystawiony na działanie wysokiej temperatury).Nie wystawiaj żelu DNA na działanie promieni UV przez dłuższy czas, ponieważ światło ultrafioletowe może spowodować uszkodzenie DNA.
5. Całkowicie rozpuścić żel w kroku 2 programu ekstrakcji 08-1/Gel, w przeciwnym razie skuteczność odzyskiwania DNA będzie poważnie ograniczona.
6. Podgrzej bufor do elucji lub ddH2O do temperatury 55°C, co jest pomocne w poprawie wydajności elucji DNA.Zaleca się przechowywanie DNA w eluencie 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
