Proteinaza K mNGS (płyn)
Proteinaza K jest stabilną proteazą serynową o szerokiej specyficzności substratowej.Rozkłada wiele białek w stanie natywnym nawet w obecności detergentów.Dowody z badań struktury krystalicznej i molekularnej wskazują, że enzym należy do rodziny subtylizyn z triadą katalityczną miejsca aktywnego (Asp39-Jego69-Ser224).Dominującym miejscem rozszczepienia jest wiązanie peptydowe sąsiadujące z grupą karboksylową aminokwasów alifatycznych i aromatycznych z zablokowanymi grupami alfa-aminowymi.Jest powszechnie stosowany ze względu na swoją szeroką specyfikę.Ta proteinaza K została specjalnie zaprojektowana dla mNGS.W porównaniu z inną proteinazą K zawiera jeszcze mniej zanieczyszczeń kwasami nukleinowymi przy tej samej wydajności enzymatycznej, co może lepiej zapewnić dalsze zastosowanie mNGS.
Warunki przechowywania
2-8 ℃ przez 2 lata
Specyfikacja
| Wygląd | Bezbarwna do jasnobrązowej ciecz |
| Działalność | ≥800 j./ml |
| Stężenie białka | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Nie wykryto żadnego |
| DNaza | Nie wykryto żadnego |
| RNaza | Nie wykryto żadnego |
Nieruchomości
| Numer WE | 3.4.21.64(Rekombinacja z albumu Tritirachium) |
| Punkt izoelektryczny | 7,81 |
| Optymalne pH | 7,0-12,0 Rys. 1 |
| Optymalna temperatura | 65 ℃ Ryc. 2 |
| stabilność pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Ryc. 3 |
| Stabilność termiczna | Poniżej 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Ryc. 4 |
| Stabilność przechowywania | Ponad 90% aktywności przez 12 miesięcy w temperaturze 25 ℃ |
| Aktywatory | SDS, mocznik |
| Inhibitory | fluorofosforan diizopropylu;fluorek fenylometylosulfonylu |
Aplikacje
1. Zestaw do diagnostyki genetycznej
2. Zestawy do ekstrakcji RNA i DNA
3. Ekstrakcja składników niebiałkowych z tkanek, degradacja zanieczyszczeń białkowych, np. DNAszczepionki i wytwarzanie heparyny
4. Przygotowanie chromosomowego DNA metodą elektroforezy pulsacyjnej
5. Western blot
6. Odczynniki enzymatyczne glikozylowanej albuminy do diagnostyki in vitro
Środki ostrożności
Podczas używania lub ważenia należy nosić rękawice i okulary ochronne, a po użyciu zapewnić dobrą wentylację.Produkt może powodować reakcję alergiczną skóry i poważne podrażnienie oczu.Wdychanie może powodować objawy alergii, astmy lub duszność.Może powodować podrażnienie dróg oddechowych.
Definicja jednostki
Jedną jednostkę (U) definiuje się jako ilość enzymu wymaganą do hydrolizy kazeiny w celu wytworzenia 1 μmolatyrozyny na minutę w następujących warunkach.
Przygotowanie odczynników
Odczynnik I: 1 g kazeiny mlecznej rozpuszczono w 50 ml 0,1 M roztworu fosforanu sodu (pH 8,0), inkubowano w wodzie o temperaturze 65-70 ℃ przez 15 minut, mieszano i rozpuszczono, ochłodzono wodą, doprowadzono wodorotlenkiem sodu do pH 8,0 i ustaloną objętość 100ml.
Odczynnik II: 0,1 M kwas trichlorooctowy, 0,2 M octan sodu, 0,3 M kwas octowy.
Odczynnik III: 0,4 M Na2CO3rozwiązanie.
Odczynnik IV: Odczynnik Forinta rozcieńczony 5-krotnie czystą wodą.
Odczynnik V: Rozcieńczalnik enzymu: 0,1 M roztwór fosforanu sodu (pH 8,0).
Odczynnik VI: roztwór tyrozyny: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tyrozyny rozpuszczonej w 0,2HCl.
Procedura
1. 0,5 ml odczynnika I podgrzać do 37°C, dodać 0,5 ml roztworu enzymu, dobrze wymieszać i inkubować w temp.37℃ przez 10 minut.
2. Dodaj 1 ml odczynnika II, aby zatrzymać reakcję, dobrze wymieszaj i kontynuuj inkubację przez 30 minut.
3. Odwirować roztwór reakcyjny.
4. Wziąć 0,5 ml supernatantu, dodać 2,5 ml odczynnika III, 0,5 ml odczynnika IV, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37°Cprzez 30 minut.
5.OD660określono jako OD1;ślepa grupa kontrolna: 0,5 ml odczynnika V stosuje się w celu zastąpienia enzymurozwiązanie do określenia OD660jako OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Krzywa standardowa L-tyrozyny: 0,5 ml roztworu L-tyrozyny o różnym stężeniu, 2,5 ml Odczynnika III, 0,5 ml Odczynnika IV w 5 ml probówce wirówkowej, inkubować w temperaturze 37°C przez 30 minut, wykryć OD660dla różnych stężeń L-tyrozyny otrzymano krzywą standardową Y=kX+b, gdzie Y to stężenie L-tyrozyny, X to OD600.
Obliczenie
2: Całkowita objętość roztworu reakcyjnego (ml)
0,5: Objętość roztworu enzymu (ml)
0,5: Objętość cieczy reakcyjnej stosowana w oznaczaniu chromogennym (ml)
10: Czas reakcji (min)
Df: Rozcieńczenie wielokrotne
C: Stężenie enzymu (mg/ml)
Bibliografia
1. Wieger U i Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U i Hilz H. Biochem.Biofizyka.Rozdzielczośćkomuna.(1971);44:513.
3.Hilz, H.i in.,EUR.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet glin., Klonowanie molekularne: podręcznik laboratoryjny, wydanie 2, Cold Spring HarborPrasa laboratoryjna, Cold Spring Harbor (1989).
Liczby
Figa.1 Optymalny pH
100 mM roztwór buforowy: pH 6,0-8,0, fosforan sodu;pH 8,0–9,0, Tris-HCl;pH 9,0-12,5, glicyna-NaOH. Stężenie enzymu: 1 mg/ml
Rys.2 Optymalna temperatura
Reakcja w 20 mM buforze K-fosforanowym o pH 8,0.Stężenie enzymu: 1 mg/ml
Ryc.3 pH Stabilność
25 ℃, 16 godz. traktowanie 50 mM roztworem buforowym: pH 4,5-5,5, octan;pH 6,0-8,0, fosforan sodu;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glicyna-NaOH.Stężenie enzymu: 1 mg/ml
Rys.4 Termiczne stabilność
30-minutowe traktowanie 50 mM buforem Tris-HCl, pH 8,0.Stężenie enzymu: 1 mg/ml
Ryc.5 Przechowywanie stabilnyty at 25 ℃
