Odwrotna transkryptaza RTL
Odwrotna transkryptaza RTL jest polimerazą DNA zależną od matrycy RNA, pozbawioną aktywności egzonukleazy 3' → 5' i posiadającą aktywność RNazy H.Enzym ten może wykorzystywać RNA jako matrycę do syntezy komplementarnej nici DNA, którą można zastosować do syntezy pierwszej nici cDNA, szczególnie w przypadku RT-LAMP (amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli).W porównaniu z odwrotną transkryptazą RTL 1.0, czułość jest znacznie poprawiona, stabilność termiczna jest silniejsza, a reakcja w temperaturze 65°C jest bardziej stabilna.Odwrotną transkryptazę RTL (bez gliceryny) można stosować do przygotowania preparatów liofilizowanych, liofilizowanych odczynników RT-LAMP itp.
Definicja jednostki
Jedna jednostka wprowadza 1 nmol dTTP do materiału wytrącającego się kwasem w ciągu 20 minut w temperaturze 50°C, stosując poli(A)·oligo(dT)25 jako starter matrycowy.
składniki
| Część | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Odwrotna transkryptaza RTL (bez gliceryny) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| Bufor 10×HC RTL | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Stan przechowywania
Transportować w temperaturze poniżej 0°C i przechowywać w temperaturze -25°C ~ -15°C.
Kontrola jakości
- Pozostała działalnośćEndonukleaza:Reakcja o objętości 50 µl, zawierająca 1 µg λDNA i 15 jednostek RTL2.0, inkubowana przez 16 godzin w temperaturze 37°C, wykazuje taki sam wzór jak kontrola ujemna metodą elektroforezy żelowej.
- Pozostała działalnośćEgzonukleaza:Reakcja 50 µl zawierająca 1 µg λDNA trawionego HindⅢ i 15 jednostek RTL2.0 inkubowanych przez 16 godzin w temperaturze 37°C wykazuje taki sam wzór jak kontrola ujemna metodą elektroforezy żelowej.
- Pozostała działalnośćNickase:Reakcja o objętości 50 µl zawierająca 1 µg superskręconego pBR322 i 15 jednostek RTL2.0 inkubowana przez 4 godziny w temperaturze 37°C wykazuje taki sam wzór jak kontrola ujemna metodą elektroforezy żelowej.
- Pozostała działalnośćRNaza:Reakcja o objętości 10 µl, zawierająca 0,48 µg RNA MS2 i 15 jednostek RTL2.0, inkubowana przez 4 godziny w temperaturze 37°C, wykazuje taki sam wzór jak kontrola ujemna metodą elektroforezy żelowej.
- E coli gDNA:Mierzone zE colispecyficzne zestawy do wykrywania HCD, 15 jednostek RTL2.0 zawiera mniej niż 1E coligenom.
Konfiguracja reakcji
Protokół syntezy cDNA
| składniki | Tom |
| Szablon RNA | opcjonalny |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) lub losowa mieszanka podkładów (60uM) | 2 µl |
| Mieszanka dNTP (10 mM każdy) | 1 µl |
| Inhibitor RNazy (40U/uL) | 0,5 µl |
| Odwrotna transkryptaza RTL 2.0 (15U/uL) | 0,5 µl |
| Bufor 10×HC RTL | 2 µl |
| Woda wolna od nukleaz | Do 20 µl |
Uwagi:
1) Zalecana dawka całkowitego RNA wynosi 1 ng ~ 1 μg
2) Zalecana dawka mRNA wynosiła 50 ng ~ 100 ng
Termo-jazda na rowerze Warunki rutyny reakcja:
| Temperatura (°C) | Czas |
| 25°Ca | 5 minut |
| 55°C | 10 minutb |
| 80°C | 10 minut |
Uwagi:
1) Jeśli używana jest losowa mieszanka starterów, etap inkubacji w temperaturze 25°C.
2) Jeśli używana jest docelowa mieszanka starterów, etap inkubacji w temperaturze 55°C przez 10~30 minut.
Protokół RT-LAMP
| składniki | Tom | Końcowe stężenie |
| Szablon RNA | opcjonalny | ≥10 kopii |
| Mieszanka dNTP (10 mM) | 3,5 µl | 1,4 mM |
| Podkłady FIP/BIP (25×) | 1 µl | 1,6 µM |
| Podkłady F3/B3 (25×) | 1 µl | 0,2 µM |
| Podkłady LoopF/LoopB (25×) | 1 µl | 0,4 µM |
| Inhibitor RNazy (40U/μL) | 0,5 µl | 20 U/reakcja |
| Odwrotna transkryptaza RTL 2.0 (15U/μL) | 0,5 µl | 7,5 U/reakcja |
| Polimeraza DNA Bst V2 (8U/μL) | 1 µl | 8 U/Reakcja |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 µl | 6 mM (łącznie 8 mM) |
| Bufor 10×HC RTL (lub bufor 10×HC Bst V2) | 2,5 µl | 1 × (2mM Mg2+) |
| Woda wolna od nukleaz | Do 25 µL | - |
Uwagi:
1) Wymieszać przez worteksowanie i krótko odwirować w celu zebrania.Inkubacja w stałej temperaturze w 65°C przez 1 godzinę.
2) Obydwa bufory są interoperacyjne i mają ten sam skład.
Notatki
1. Ten produkt będzie tworzył białą substancję stałą, jeśli będzie przechowywany w temperaturze -20°C.Wyjmij z -20°C i włóż do lodu na około 10 minut.Po stopieniu można go używać poprzez wstrząsanie i mieszanie.
2. Produkt cDNA można przechowywać w temperaturze -20°C lub -80°C lub natychmiast wykorzystać do reakcji PCR.
3. Aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą, należy utrzymywać obszar doświadczalny w czystości, a podczas pracy nosić czyste rękawiczki i maski.
