Dzika polimeraza DNA Taq
Polimeraza DNA Taq jest termostabilną polimerazą DNA z Thermus aquaticus YT-1, która posiada aktywność polimerazy 5′ → 3′ i aktywność endonukleazy płatkowej 5’.
składniki
| Część | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| 10× Bufor Taq | 2×1ml | 2×10 ml | 2×50 ml | 5×200 ml |
| Polimeraza DNA Taq (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 5×10 ml |
Stan przechowywania
Transportować w temperaturze poniżej 0°C i przechowywać w temperaturze -25°C ~ -15°C.
Definicja jednostki
Jedną jednostkę definiuje się jako ilość enzymu, która włącza 15 nmoli dNTP do materiału nierozpuszczalnego w kwasie w ciągu 30 minut w temperaturze 75°C.
Kontrola jakości
1.Test czystości białka (SDS-PAGE):Czystość polimerazy DNA Taq wynosiła ≥95%, co określono metodą analizy SDS-PAGE.
2.EndAktywność onukleazy:Co najmniej 5 U polimerazy DNA Taq z 1 μg λDNA przez 16 godzin w temperaturze 37 ℃ nie powoduje wykrywalnej degradacji, jak określono.
3.Aktywność egzonukleazy:Co najmniej 5 U polimerazy DNA Taq z 1 μg DNA trawionego λ -Hind Ⅲ przez 16 godzin w temperaturze 37 ℃ nie powoduje wykrywalnej degradacji, jak określono.
4.Aktywność Nickase'a:Co najmniej 5 U polimerazy DNA Taq z 1 µg DNA pBR322 przez 16 godzin w temperaturze 37°C nie powoduje wykrywalnej degradacji, jak określono.
5.Aktywność RNazy:Co najmniej 5 U polimerazy DNA Taq z 1,6 μg RNA MS2 przez 16 godzin w temperaturze 37°C nie powoduje wykrywalnej degradacji, jak określono.
6.E coliDNA:5 U polimerazy DNA Taq przeszukuje się pod kątem obecności genomowego DNA E. coli przy użyciu TaqMan qPCR ze starterami specyficznymi dla locus 16S rRNA E. coli.Zanieczyszczenie genomowym DNA E. coli wynosi ≤1 kopia.
7.Amplifikacja PCR (5,0 kb Lambda DNA)- Reakcja 50 µl zawierająca 5 ng DNA Lambda z 5 jednostkami polimerazy DNA Taq przez 25 cykli amplifikacji PCR daje oczekiwany produkt o wielkości 5,0 kb.
Konfiguracja reakcji
| składniki | Tom |
| Szablon DNAa | opcjonalny |
| 10 μM podkład do przodu | 1 µl |
| 10 µM podkład odwrócony | 1 µl |
| Mieszanka dNTP (10 mM każdy) | 1 µl |
| 10×Bufor Taq | 5 µL |
| Polimeraza DNA TaqB | 0,25 µl |
| Woda wolna od nukleaz | Do 50 µl |
Uwagi:
1) Optymalne stężenie reakcji dla różnych matryc jest różne.Poniższa tabela przedstawia zalecane użycie szablonu dla 50 µl układu reakcyjnego.
| DNA | Kwota |
| Genomowy | 1 ng-1 µg |
| Plazmid lub wirus | 1 str.-1 ng |
2) Optymalne stężenie polimerazy DNA Taq może mieścić się w zakresie od 0,25 µL ~ 1 µL w specjalistycznych zastosowaniach.
ReakcjaProgram
| Krok | Temperatura(°C) | Czas | Cykle |
| Początkowa denaturacjaa | 95 ℃ | 5 minut | - |
| Denaturacja | 95 ℃ | 15-30 sek | 30-35 cykli |
| WyżarzanieB | 60 ℃ | 15 s | |
| Rozszerzenie | 72 ℃ | 1kb/min | |
| Ostateczne przedłużenie | 72 ℃ | 5 minut | - |
Uwagi:
1) Początkowe warunki denaturacji są odpowiednie dla większości reakcji amplifikacji i można je modyfikować w zależności od złożoności struktury matrycy.Jeśli struktura matrycy jest złożona, czas wstępnej denaturacji można wydłużyć do 5–10 minut, aby poprawić początkowy efekt denaturacji.
2) Temperaturę wyżarzania należy dostosować zgodnie z wartością Tm podkładu, która jest zwykle ustawiona na 3 ~ 5 ℃ niższą niż wartość Tm podkładu;W przypadku złożonych szablonów konieczne jest dostosowanie temperatury wyżarzania i wydłużenie czasu wydłużania, aby uzyskać efektywne wzmocnienie.
