Polimeraza DNA Hotstart Taq
Polimeraza DNA Taq Hot Start (modyfikacja przeciwciał) to termostabilna polimeraza DNA Hot Start z Thermus aquaticus YT-1, która posiada aktywność polimerazy 5′ → 3′ i aktywność endonukleazy płatkowej 5’.Polimeraza DNA Taq typu gorący start jest polimerazą DNA Taq zmodyfikowaną termolabilnymi przeciwciałami Taq.Modyfikacja przeciwciał zwiększyła swoistość, czułość i wydajność PCR.
składniki
| Część | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×bufor HC Taq | 4×1 ml | 4×10 ml | 4×50 ml | 5×400 ml |
| Polimeraza DNA Hot Start Taq (modyfikowane przeciwciało) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10×5 ml |
Aplikacje
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 w 25°C), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 i 50% gliceryny.
Stan przechowywania
Transportować w temperaturze poniżej 0°C i przechowywać w temperaturze -25°C ~ -15°C.
Definicja jednostki
Jedną jednostkę definiuje się jako ilość enzymu, która włącza 15 nmoli dNTP do materiału nierozpuszczalnego w kwasie w ciągu 30 minut w temperaturze 75°C.
Kontrola jakości
1.EndAktywność onukleazy:Inkubacja 20 U enzymu z 4 µg DNA pUC19 przez 4 godziny w temperaturze 37°C nie spowodowała wykrywalnej degradacji DNA, jak określono metodą elektroforezy żelowej.
2.5 kb Lambda PCR:25 cykli amplifikacji PCR 5 ng DNA Lambda z 1,25 jednostkami polimerazy DNA Taq w obecności 200 µM dNTP i 0,2 µM starterów daje oczekiwany produkt o wielkości 5 kb.
3.Aktywność egzonukleazy:Inkubacja 50 µl mieszaniny reakcyjnej zawierającej minimum 12,5 U polimerazy DNA Taq z 10 nmolami oligonukleotydu 5'-FAM przez 30 minut w temperaturze 37°C nie powoduje wykrywalnej degradacji.
4.Aktywność RNazy:Inkubacja 10 µl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 20 U enzymu z 1 µg transkryptów RNA przez 2 godziny w temperaturze 37°C nie spowodowała wykrywalnej degradacji RNA, co określono metodą elektroforezy żelowej.
5.Inaktywacja cieplna:NIE.
Układ reakcji
| składniki | Tom |
| Szablon DNAa | opcjonalny |
| 10 μM podkład do przodu | 0,5 µl |
| 10 µM podkład odwrócony | 0,5 µl |
| Mieszanka dNTP (10 mM każdy) | 0,5 µl |
| 5×bufor HC Taq | 5 µL |
| Polimeraza DNA TaqB(5U/µl) | 0,125 μl |
| Woda wolna od nukleaz | Do 25 µL |
Uwagi:
1)
| DNA | Kwota |
| Genomowy | 1 ng-1 µg |
| Plazmid lub wirus | 1 str.-1 ng |
2) b.Optymalne stężenie polimerazy DNA Taq może mieścić się w zakresie 5-50 jednostek/ml (reakcja 0,1-0,5 jednostek/25 µl) w zastosowaniach specjalistycznych.
Protokół cyklu termicznego
PCR
| Krok | Temperatura(°C) | Czas | Cykle |
| Początkowa denaturacjaa | 95 ℃ | 1-3 minuty | - |
| Denaturacja | 95 ℃ | 15-30 sek | 30-35 cykli |
| WyżarzanieB | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Rozszerzenie | 68 ℃ | 1kb/min | |
| Ostateczne przedłużenie | 68 ℃ | 5 minut | - |
Uwagi:
1) W przypadku większości amplifikacji wystarczająca jest początkowa denaturacja trwająca 1 minutę w temperaturze 95°C.W przypadku trudnych szablonów zaleca się dłuższą denaturację wynoszącą 2-3 minuty w temperaturze 95°C.W przypadku PCR na koloniach zaleca się początkową denaturację przez 5 minut w temperaturze 95°C.
2) Etap wyżarzania trwa zazwyczaj 15–60 sekund.Temperatura wyżarzania opiera się na Tm pary podkładów i zazwyczaj wynosi 45-68℃.
